บทที่ 1
ความหมาย ประวัติศาสตร์ และการประยุกต์เทคโนโลยีชีวภาพ
ในปัจจุบันความก้าวหน้าทางเทคโนโลยีมีส่วนในการทำให้มนุษย์มีความสะดวกสบายในการใช้ชีวิต มีเทคโนโลยีสาขาหนึ่งที่มีผลกระทบต่อมนุษย์โดยตรงที่จะทาให้มนุษย์มีปัจจัยสี่ ได้แก่ อาหาร ที่อยู่อาศัย เครื่องนุ่งห่ม และยารักษาโรค ที่ตอบสนองความต้องการของมนุษย์ เทคโนโลยีดังกล่าวคือเทคโนโลยีชีวภาพ (biotechnology)
1.1 ความหมายของเทคโนโลยีชีวภาพ
เทคโนโลยีชีวภาพเกิดจากการนาคำที่มีความหมาย 3 คำมารวมกัน โดยเริ่มจาก Bio หรือ Bios ซึ่งหมายถึงสิ่งมีชีวิตและตามด้วย Techno หรือ Technikos ซึ่งแปลว่าเครื่องมือ ส่วนคำสุดท้ายคือ logy หรือ logos ซึ่งแปลว่าการศึกษา เมื่อรวมความหมายของทั้ง 3 คำจึงได้ ความหมายของเทคโนโลยีชีวภาพ
เทคโนโลยีชีวภาพ หมายถึง การนำความรู้เกี่ยวกับสิ่งมีชีวิต หรือกระบวนการของปฏิกิริยาชีวเคมีที่เกิดขึ้นในสิ่งมีชีวิตมาประยุกต์ใช้ในทางอุตสาหกรรมเพื่อให้เกิดผลิตภัณฑ์ที่ก่อให้เกิดประโยชน์กับมนุษย์ (ภาพที่ 1.1) เช่น การผลิตขนมปัง การผลิตยาปฏิชีวนะ การสร้างพันธุ์พืชต้านทานโรค การใช้จุลินทรีย์ (microorganism) บำบัดน้าเสีย และการใช้จุลินทรีย์ผลิตก๊าซไฮโดรเจน เป็นต้น นอกจากนี้ เทคโนโลยีชีวภาพตามความหมายของ องค์กร OECD (Organization for Economic Co – operative and Development) หมายถึง การประยุกต์ใช้หลักการทางวิทยาศาสตร์และวิศวกรรมศาสตร์ เพื่อผลิต ผลิตภัณฑ์ โดยใช้สารชีวภาพเป็นสารตั้งต้น
ภาพที่ 1.1 ความหมายทางเทคโนโลยีชีวภาพ 2
1.2 ประวัติศาสตร์เทคโนโลยีชีวภาพ
คำว่าเทคโนโลยีชีวภาพมีการเริ่มใช้ตั้งแต่ปี ค.ศ.1919 โดยนักเศษฐศาสตร์ชาวฮังการี ชื่อว่า Karoly(Karl) Ereky (Bains W. , 2004)เป็นต้นมา ในสมัยต้นๆ เทคโนโลยีชีวภาพจะมีความเกี่ยวข้องกับจุลินทรีย์เป็นหลัก ในอดีตก่อนหน้าที่จะมีคาว่าเทคโนโลยีชีวภาพนั้นก็มีการนาความรู้ทางเทคโนโลยีชีวภาพมาใช้ประโยชน์ และมีการพัฒนาความรู้จนถึงปัจจุบันดังแสดงในตารางที่ 1.1
ตารางที่ 1.1 พัฒนาการทางเทคโนโลยีชีวภาพ
|
เวลา |
เหตุการณ์ |
|
ก่อนประวัติศาสตร์ |
การทำเบียร์โดยพวกซูเมเรียน และชาวบาบิโลเนียน การทำขนมปังโดยชาวอียิปต์ การผลิตเสื้อผ้าและการย้อมสี |
|
ค.ศ.1700-1800 |
การค้นพบจุลินทรีย์และนาไปใช้ประโยชน์ในด้านต่างๆ เช่น ด้านอาหาร โดยแบคทีเรียช่วยผลิตนมเปรี้ยว การผลิตน้าปลาและซีอิ้ว โดยจุลินทรีย์ เป็นต้น |
|
ค.ศ.1800-1900 |
การนำจุลินทรีย์มาใช้ในกระบวนการหมัก การนำจุลินทรีย์มาใช้ในกระบวนการผลิตยาปฏิชีวนะ กรดอะมิโน กรดอินทรีย์ เอนไซม์และวัคซีน เป็นต้น |
|
ค.ศ.1900-ปัจจุบัน |
การพัฒนาความรู้ทางด้านชีววิทยาระดับโมเลกุล (molecular biology) กระบวนการพันธุวิศวกรรม (genetic engineering) การศึกษาพันธุกรรมทั้งหมดของมนุษย์ |
จากตารางที่ 1.1 พัฒนาการทางเทคโนโลยีชีวภาพ สามารถที่จะแบ่งการพัฒนาออกเป็น 2 ระยะ (Barnum, R.S. 2005) ได้แก่
1.2.1 เทคโนโลยีชีวภาพสมัยเก่า (classical biotechnology)
เทคโนโลยีชีวภาพสมัยเก่านั้นเป็นการใช้ความรู้ทางด้านจุลชีววิทยา (microbiology) และกระบวนการหมัก (fermentation) เพื่อผลิตเครื่องดื่มหรืออาหารให้แก่มนุษย์ ตัวอย่างเช่น การใช้เชื้อยีสต์ (yeast) ผลิตเครื่องดื่มที่มีแอลกอฮอล์ โดยใช้กระบวนการหมัก การผลิตกรดน้าส้มสายชูโดยเชื้อแบคทีเรียสกุลอะซีโตแบคเตอร์ (Acetobacter sp.) การผลิตยาปฏิชีวนะเพนนิซิลิน (penicillin) โดยเชื้อราสกุลเพนนิซิลเลียม (Penicillium sp.) เป็นต้น ต่อมาในยามสงครามโลกครั้งที่ 1 ประเทศอังกฤษขาดแคลน อะซีโตน ซึ่งเป็นสิ่งสาคัญในสงคราม ความรู้ทางเทคโนโลยีชีวภาพก็ได้นามาใช้ในการผลิตอะซีโตนจากแป้ง ทาให้เกิดเป็นอุตสาหกรรม ต่อมาเกิดสงครามโลกครั้งที่ 2 ก็มีการใช้ความรู้ทางเทคโนโลยีชีวภาพในการผลิตยาปฏิชีวนะ เช่น การผลิตยาเพนิซิลินจากรา เป็นต้น (ภาพที่ 1.1)
ภาพที่ 1.1 เทคโนโลยีชีวภาพสมัยเก่า
ที่มา : (Schmidt, 2003, p. 3)
1.2.2 เทคโนโลยีชีวภาพสมัยใหม่ (modern biotechnology)
เทคโนโลยีชีวภาพสมัยใหม่ที่เกิดขึ้นนั้นเกิดจากการพัฒนาความรู้ทางด้านชีววิทยาระดับโมเลกุลที่มีความก้าวหน้าอย่างสูง โดยเฉพาะการพัฒนาความรู้เรื่องที่เกี่ยวข้องกับสารพันธุกรรม (genetic material) ซึ่งก่อให้เกิดการปรับปรุงพันธุ์สิ่งมีชีวิตชนิดต่าง ๆ เพื่อก่อให้เกิดประโยชน์ต่อมนุษย์ เทคโนโลยีชีวภาพสมัยใหม่จะมีความเกี่ยวข้องระดับเซลล์หรือต่ากว่าระดับเซลล์ นั่นหมายถึงยีน (gene) หรือมีเทคโนโลยีเกี่ยวกับยีนมาเป็นส่วนสาคัญในการพัฒนาความรู้ต่อไปในอนาคต (มาลี สุวรรณอัตถ์, 2527)
จากที่กล่าวถึงการพัฒนาความรู้ทางเทคโนโลยีชีวภาพทั้งสมัยเก่าและใหม่นั้นก็เกิดจากการทางานของนักวิทยาศาสตร์จากอตีดถึงปัจจุบันในที่นี้จะขอยกตัวอย่างนักวิทยาศาสตร์ที่มีความสาคัญต่อการพัฒนาเทคโนโลยีชีวภาพ
– Robert Hooks (ค.ศ. 1665)
ได้ประดิษฐ์กล้องจุลทรรศน์เลนส์ประกอบและเป็นคนแรกที่สังเกตเห็นเซลล์(cell)ในไม้คอรก์
– Antony Van Leeuwenhoek (ค.ศ. 1675)
ได้ค้นพบจุลินทรีย์ต่างๆที่อยู่ในหยดน้าโดยใช้กล้องจุลทรรศน์
– Gregor Mendel (ค.ศ. 1863)
ได้ทำการทดลองทางพันธุศาสตร์โดยใช้ถั่วลันเตาทาให้เกิดกฎทางพันธุศาสตร์โดยสรุปว่าต้องมีปัจจัยอะไรซักอย่างที่ควบคุมลักษณะของสิ่งมีชีวิต
– Friederich Miecher (ค.ศ. 1869)
ได้ค้นพบสารพันธุกรรมที่เรียกว่าดีเอ็นเอจากปลาเทราซ์ (trout)
– Louis Pasteur (ค.ศ. 1870)
ได้ค้นพบกระบวนการหมักและศึกษาการเน่าเสียของอาหารว่าเกิดจากจุลินทรีย์
– James Watson and Francis Crick (ค.ศ. 1953)
ได้ค้นพบโครงสร้างของดีเอ็นเอ โดยใช้เทคนิค X – ray diffraction
– Paul Berg (ค.ศ. 1972)
ได้ทำการสร้างดีเอ็นเอลูกผสม (recombinant DNA) และได้มีการย้ายดีเอ็นเอลูกผสมจากสิ่งมีชีวิตหนึ่งไปอีกสิ่งมีชีวิตหนึ่ง
1.3 สาขาและการประยุกต์ใช้ความรู้ทางเทคโนโลยีชีวภาพ
เทคโนโลยีชีวภาพมีความเป็นสหสาขาวิชา (multidisciplinary) คือเป็นการรวมความรู้ทางวิทยาศาสตร์หลาย ๆ ด้าน ได้แก่ ชีววิทยา (biology) ชีววิทยาของเซลล์ (cell biology) พฤกษศาสตร์ (botany) สัตว์วิทยา (zoology) สรีรวิทยา (physiology) จุลชีววิทยา พันธุศาสตร์ (genetics) ชีวเคมี (biochmistry) คณิตศาสตร์ (mathematics) วิทยาการคอมพิวเตอร์ (computer science) และวิศวกรรมเคมี (chemical enginering) เป็นต้น จากความรู้ที่หลากหลายดังที่กล่าวไปทาให้เกิดสาขาใหม่ ๆ ที่ใช้ในการพัฒนาเทคโนโลยีชีวภาพ ได้แก่ พันธุวิศวกรรม (genetic engineering) วิศวกรรมเอนไซม์ (enzyme engineering) เทคโนโลยีการหมัก (fermentation technology) และวิศวกรรมกระบวนการชีวภาพ (bioprocess engineering) ซึ่งจะได้กล่าวในรายละเอียดในบทต่อ ๆ ไป (ภาพที่ 1.2)
ภาพที่ 1.2 รากฐานของเทคโนโลยีชีวภาพและการประยุกต์ใช้
ที่มา : (Schmidt, 2003, p. 5)
ในปัจจุบันการศึกษาทางด้านเทคโนโลยีชีวภาพมีการพัฒนาก่อนให้เกิดความรู้ใหม่ ๆ เช่น การศึกษาพันธุกรรมทั้งหมดของสิ่งมีชีวิต ที่เรียกว่า จีโนมิกส์ (genomics) การศึกษาเรื่องของเซลล์ในระดับลึก ที่เรียกว่า เซลล์โลมิกส์ (cellomics) นาไปสู่ความเข้าใจสิ่งมีชีวิตในระดับเนื้อเยื่อ ก่อให้เกิดความรู้ที่เรียกว่า วิศวกรรมเนื้อเยื่อ (tissue engineering) เทคโนโลยีชีวภาพกับคอมพิวเตอร์ และระบบอินเทอร์เน็ตมีการทางานรวมกันโดยนาข้อมูลรหัสพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิต ทาเป็นฐานข้อมูลและใช้ในการสืบค้นโดยใช้ระบบคอมพิวเตอร์ เรียกสาขาวิชาทางด้านนี้ว่า ชีวสารสนเทศ (bioinformatics) นอกจากเรื่องนี้แล้ว ยังใช้โปรแกรมคอมพิวเตอร์ในการทานายโครงสร้างโปรตีนที่เปลี่ยนไปเนื่องจากมีการเปลี่ยนแปลงกรดอะมิโนในสายโพลีเปปไทด์ (polypeptide) หรือใช้โปรแกรมคอมพิวเตอร์ในการสร้างสภาวะจาลอง (simulation) ของกระบวนการหมัก
จากความรู้ที่กล่าวมาทั้งหมดข้างต้น เทคโนโลยีชีวภาพมีความเกี่ยวข้องกับความรู้หลายสาขา ดังนั้นจึงแบ่งออกโดยอาศัยชนิดของสิ่งมีชีวิตได้เป็น 3 หัวข้อ ดังนี้
1.3.1 เทคโนโลยีชีวภาพจุลินทรีย์ (microbial biotechnology)
จุลินทรีย์เป็นสิ่งมีชีวิตที่มีขนาดเล็กได้แก่ แบคทีเรีย(bacteria) ยีสต์(yeast) และรา(mold) เป็นต้น จุลินทรีย์มีความสาคัญต่อกระบวนการเทคโนโลยีชีวภาพ เนื่องจากเจริญเติบโตได้อย่างรวดเร็ว พร้อมกันนั้นยังผลิตสารต่าง ๆ ที่มนุษย์ต้องการได้อย่างมีความหลากหลาย มีการนา
จุลินทรีย์มารวมกับความรู้ทางด้านเทคโนโลยีชีวภาพเพื่อประยุกต์ใช้งานในด้านต่างๆ ดังต่อไปนี้ (สถาบันวิจัยวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งประเทศไทย, 2544)
1.3.1.1 เทคโนโลยีชีวภาพจุลินทรีย์กับอาหาร
มีการนำจุลินทรีย์จาพวกยีสต์บางชนิดมาทาเป็นอาหารที่เรียกว่าโปรตีนเซลล์เดียว (single cell protein , SCP) กระบวนการผลิต คือ นายีสต์มาเลี้ยงในถังหมัก (reactor) ที่สามารถควบคุมภาวะที่เหมาะสมต่อการเจริญของยีสต์ ทาให้ได้ผลผลิตยีสต์จานวนมาก เมื่อผ่านกระบวนการหมัก นอกจากนี้จุลินทรีย์ยังสามารถช่วยทาให้เกิดอาหารที่มีรสชาดแตกต่างและทาให้อาหารน่ารับประทานเพิ่มขึ้น เช่น แบคทีเรียแลกติก (lactic acid bacteria) ก่อให้เกิดนมเปรี้ยว โยเกิร์ต หรืออาหารพวกแหนม จุลินทรีย์จาพวกราใช้ในการทาซีอิ๊วและเต้าเจี้ยว กระบวนการหมักที่เกิดขึ้นโดยจุลินทรีย์ยังสามารถผลิตสารต่าง ๆ ที่เกี่ยวข้องกับอาหาร เช่น การผลิตกรดอะมิโน หรือเอนไซม์ (enzymes)
1.3.1.2 เทคโนโลยีชีวภาพจุลินทรีย์กับการแพทย์
ได้มีการนาเอาจุลินทรีย์มาใช้ในการผลิตยาปฏิชีวนะหลายชนิดเช่น ยาเพนนิ-
ซิลลิน จากเชื้อรา Penicillium notatum มีการใช้แบคทีเรียในการผลิตฮอร์โมนอินซูลิน(insulin hormone) เพื่อใช้รักษาโรคเบาหวาน ฮอร์โมนควบคุมการเจริญเติบโต (growth hormone) เพื่อใช้รักษาโรคแคระแกร็นของมนุษย์ และสารอินเทอร์ฟีรอน (interferon) เพื่อใช้รักษาโรคมะเร็ง
1.3.1.3 เทคโนโลยีชีวภาพจุลินทรีย์กับสิ่งแวดล้อม
ในธรรมชาติจุลินทรีย์ทาหน้าที่เป็นผู้ย่อยสลายสารอินทรีย์ ดังนั้นจึงมีการนาเอาจุลินทรีย์ มาใช้เพื่อย่อยสลายสารต่างๆ เพื่อลดปริมาณขยะมูลฝอยเช่น ใช้จุลินทรีย์อีเอ็ม (effective microorganism) ร่วมกับจุลินทรีย์ที่เป็นประโยชน์ต่อพืชในการหมักเศษพืช เศษอาหาร และซากอินทรีย์สารทาให้ได้น้าหมักชีวภาพหรือปุ๋ยชีวภาพเพื่อใช้รดต้นไม้ทาให้ต้นไม้เจริญเติบโตดี นอกจากนี้ยังใช้แบคทีเรีย (Pseudomonas sp. และ Acinetobacter sp.) ย่อยสลายคราบน้ามันที่ปนเปื้อนในทะเลได้ ซึ่งมีผลทาให้สิ่งแวดล้อมสะอาดขึ้น นอกจากนี้ยังใช้จุลินทรีย์เพื่อผลิตพลังงานทดแทนเช่น ผลิตแก๊สชีวภาพ (biogas) ซึ่งเกิดขึ้นจากกระบวนการหมักจุลินทรีย์กับเศษวัสดุเหลือใช้ทางการเกษตรและใช้ยีสต์ในการผลิตแอลกอฮอล์ โดยนายีสต์มาหมักรวมกับกากน้าตาลเพื่อให้ได้แอลกอฮอล์ แล้วนาแอลกอฮอล์ไปผสมกับน้ามันเบนซินเพื่อทาเป็นแก๊สโซฮอล์ (gasohol) และในอนาคตจะมีพลังงานสะอาดที่ไม่ทาลายสิ่งแวดล้อมซึ่งได้จากจุลินทรีย์เช่น การใช้จุลินทรีย์ผลิตพลังงานไฮโดรเจนและผลิตกระแสไฟฟ้า เป็นต้น
1.3.2 เทคโนโลยีชีวภาพพืช (plant biotechnology)
ในระบบนิเวศพืชทาหน้าที่เป็นผู้ผลิตและเป็นอาหารสาหรับสัตว์รวมถึงมนุษย์ด้วย ดังนั้นจึงต้องมีการขยายพันธุ์พืชเพื่อให้ได้พืชจานวนมากและมีการปรับปรุงพันธุ์พืชเพื่อให้ได้พันธุ์พืชที่ตรงกับความต้องการของมนุษย์ เทคโนโลยีที่นามาใช้คือการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช (plant tissue culture) ซึ่งเป็นการขยายพันธุ์พืชโดยใช้ชิ้นส่วนหรือเซลล์ของพืชมาเพาะเลี้ยงในอาหารสังเคราะห์เพื่อให้ได้ต้นพืชที่ตรงตามความต้องการของมนุษย์และได้ปริมาณมากในระยะเวลาสั้น นอกจากนี้การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชยังนามาใช้ประโยชน์ในการผลิตพืชที่ปราศจากโรคและการสร้างพืชที่มีจานวนโครโมโซมเพิ่มขึ้นหรือลดลงจากเดิม ในปัจจุบันได้มีการนากระบวนการทางพันธุวิศวกรรมพืชเข้ามาใช้เพื่อตัดแต่งยีนของพืช โดยการใส่ยีนที่ไม่ใช่ของพืชเข้าไปในพืชเช่น นายีนที่สร้างสารพิษของแบคทีเรียที่มีชื่อวิทยาศาสตร์ว่า Bacillus thuringiensis (บีที : Bt) ใส่เข้าไปในพืชบางชนิด (เช่น ฝ้าย ข้าวโพด และถั่วเหลือง) เพื่อทาให้พืชสามารถสร้างโปรตีนที่เป็นพิษต่อแมลง แต่ไม่เป็นพิษต่อมนุษย์เป็นผลทาให้มีการฉีดยาฆ่าแมลงน้อยลง นอกจากนี้ยังมีการสร้างพันธุ์มะละกอที่สามารถต้านทานต่อโรคไวรัสจุดด่างวงแหวน ประเทศไทยได้เข้าร่วมโครงการจีโนม(genome) ข้าวนานาชาติ โดยรับผิดชอบในเรื่องการหาลาดับเบสในโครโมโซมคู่ที่ 9 ของข้าวและค้นหายีนในข้าวที่ทนต่อสภาพแห้งแล้ง ยีนที่ให้ความหอม และยีนที่ทนต่อสภาพน้าท่วม ในอนาคตจะมีการใช้เทคโนโลยีชีวภาพพืชเพื่อสร้างพืชที่ผลิตพลาสติก ข้าวสีทองที่มีวิตามินเอสูงและพืชที่สามารถผลิตวัคซีนป้องกันโรคได้
1.3.3 เทคโนโลยีชีวภาพสัตว์ (animal biotechnology)
เทคโนโลยีชีวภาพสัตว์มีจุดเริ่มต้นมาจากเมื่อสามารถเปลี่ยนถ่ายนิวเคลียสซึ่งเป็นแหล่งรวมพันธุกรรมในกบได้เป็นผลสาเร็จ ปัจจุบันเทคโนโลยีด้านนี้ได้ก้าวหน้าไปไกลมาก โดยเมื่อ พ.ศ. 2540 ดร. เอียน วิลมุต ใช้กระบวนการโคลนนิ่ง (cloning) สร้างแกะที่มีลักษณะเหมือนกับแกะที่เป็นเจ้าของเซลล์ต้นกาเนิดทุกประการได้เป็นผลสำเร็จ แล้วตั้งชื่อแกะที่ได้จากการโคลนนิ่งนี้ว่า “ ดอล-ลี่ ” ซึ่งเป็นแกะที่ถูกสร้างขึ้นจากเซลล์ของแกะที่โตเต็มที่แล้ว ในปัจจุบันได้ทาการทดลองโคลนนิ่งในสัตว์หลายชนิดเช่น ลิง แมว วัว และม้า
เทคโนโลยีชีวภาพสัตว์ที่มีผลโดยตรงต่อมนุษย์คือ โครงการจีโนมมนุษย์ (human genome project) ซึ่งเป็นการอ่านรหัสพันธุกรรมทั้งหมดของมนุษย์ ซึ่งรหัสพันธุกรรมนี้ประกอบด้วยเบสสี่ชนิดได้แก่ อะดีนีน (A) กวานีน (G) ไซโทซีน (C) และไทมีน (T) มาเรียงต่อกันจนกลายเป็นพันธุกรรมของมนุษย์ โครงการจีโนมมนุษย์มีประโยชน์ในการรักษาโรคทางพันธุกรรม โดยลาดับเบสในพันธุกรรมของคนที่เป็นโรคทางพันธุกรรมจะไม่เหมือนกับลาดับเบสในพันธุกรรมของคนปกติ ซึ่งวิธีการรักษาทาได้โดยการเปลี่ยนลาดับเบสในพันธุกรรมของคนที่เป็นโรคให้เหมือนกับของคนปกติ ซึ่งวิธีการรักษาในลักษณะนี้เรียกว่า การบาบัดโรคด้วยยีน (gene therapy)
ในปัจจุบันมีการตัดต่อยีนในสัตว์เพื่อสร้างสัตว์ดัดแปลงพันธุกรรมที่ให้ประโยชน์แก่มนุษย์หลายชนิดเช่น การผลิตปลาที่มีขนาดใหญ่ขึ้น โดยมีการนายีนที่สร้างฮอร์โมนเร่งการเจริญเติบโตใส่เข้าไปในปลา มีการสร้างสัตว์ปีกที่ทนทานต่อโรค การผลิตสัตว์ที่สามารถผลิตยาและวัคซีนรักษาโรคได้
ในประเทศไทยได้มีใช้เทคโนโลยีดีเอ็นเอในการตรวจวินิจฉัยโรคหัวเหลือง (เกิดจากเชื้อแบคทีเรีย) และตัวแดงจุดขาวในกุ้งกุลาดา (เกิดจากเชื้อไวรัส) เพื่อป้องกันการแพร่ระบาดของโรคดังกล่าวซึ่งเป็นผลทาให้มูลค่าการส่งออกกุ้งของประเทศไทยเพิ่มมากขึ้น เทคโนโลยีชีวภาพสัตว์ที่เกี่ยวข้องกับมนุษย์โดยเฉพาะอย่างยิ่งการทาวิจัยที่เกี่ยวกับการโคลนนิ่งมนุษย์จะต้องคานึงถึงเรื่องของชีวจริยธรรม (bioethics) ให้มากขึ้น
นอกจากการแบ่งสาขาทางเทคโนโลยีชีวภาพ ตามประเภทของสิ่งมีชีวิตแล้ว เทคโนโลยีชีวภาพยังสามารถแบ่งสาขาได้ตามการประยุกต์ใช้ ซึ่งมีหลาย ๆ ด้าน เช่น เทคโนโลยีชีวภาพอาหาร (food Biotechnology) เทคโนโลยีชีวภาพการแพทย์ (medical Biotechnology) เทคโนโลยีชีวภาพสิ่งแวดล้อม (environmental Biotechnology) เทคโนโลยีชีวภาพโปรตีน (protein Biotechnology) เทคโนโลยีชีวภาพอวกาศ (space Biotechnology) เทคโนโลยีชีวภาพอุตสาหกรรม (industrial Biotechnology) นาโนเทคโนโลยีชีวภาพ (nano- Biotechnology) เป็นต้น
1.4 การพัฒนาเทคโนโลยีชีวภาพในประเทศไทย
ประเทศไทยได้ตระหนักถึงความสาคัญของเทคโนโลยีชีวภาพต่อการพัฒนาประเทศ ว่ามีความสาคัญต่อการพัฒนาประเทศ จึงได้จัดตั้งหน่วยงานศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ (National Center for Genetic Engineering and Biotechnology : BIOTEC) ขึ้นเมื่อวันที่ 20 กันยายน พ.ศ. 2526 ภายใต้สังกัดกระทรวงวิทยาศาสตร์ เทคโนโลยี และสิ่งแวดล้อม จนกระทั่งอีก 8 ปีต่อมา ในวันที่ 30 ธันวาคม พ.ศ. 2534 จึงได้ร่วมเป็นหน่วยงานภายใต้ สานักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ (ส.ว.ท.ช.) (สถาบันวิจัยวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งประเทศไทย, 2546) ปัจจุบันศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพตั้งอยู่ที่อุทยานวิทยาศาสตร์ประเทศไทย จังหวัดปทุมธานี มีภารกิจในการสร้างความรู้ความเข้าใจและความสามารถของประเทศให้มีความพร้อมในการจัดการเทคโนโลยีที่สาคัญบนพื้นฐานของข้อมูลและเหตุผลทางวิทยาศาสตร์(ภาพที่ 1.3)
ภาพที่ 1.3 ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ
ที่มา : www.biotec.or.th
ในปัจจุบันรัฐบาลไทยได้เห็นความสาคัญของเทคโนโลยีชีวภาพโดยจะเห็นได้จากมีการจัดตั้งคณะกรรมการนโยบายเทคโนโลยีชีวภาพของประเทศ ในช่วง พ.ศ. 2547-2554 (อาสาฬห์ จิตร-แจ่ม และ เอกดนัย กอกิมพงษ์, 2547)
1. ธุรกิจชีวภาพสมัยใหม่เกิดและพัฒนา โดยมุ่งผลิตผลิตภัณฑ์ที่มีมูลค่าเพิ่ม เช่น ชุดตรวจวินิจฉัยโรคอาหารเสริมสุขภาพ และเมล็ดพันธุ์ เป็นต้น
2. ใช้เทคโนโลยีชีวภาพช่วยให้ประเทศไทยเป็นครัวของโลก
3. ประเทศไทยมีสังคมที่มีสุขภาพดี และเป็นศูนย์กลางสุขภาพแห่งเอเชียโดยใช้เทคโนโลยีชีวภาพ
4. ใช้เทคโนโลยีชีวภาพเพื่อรักษาสิ่งแวดล้อม และผลิตพลังงานสะอาด
5. ใช้เทคโนโลยีชีวภาพเป็นปัจจัยสำคัญ ของเศรษฐกิจพอเพียง โดยการใช้เทคโนโลยีชีวภาพต่อยอดกับภูมิปัญญาท้องถิ่น เพื่อพัฒนาคุณภาพของผลิตภัณฑ์ชุมชน รวมทั้งการอนุรักษ์ และการใช้ทรัพยากรในแต่ละพื้นที่
6. พัฒนาระบบการสร้างกาลังคนที่มีคุณภาพ เช่น นักวิจัย และผลิตบัณฑิตเทคโนโลยีชีวภาพ เป็นต้น
บทสรุป
เทคโนโลยีชีวภาพ หมายถึง การนาความรู้เกี่ยวกับสิ่งมีชีวิต หรือกระบวนการของผู้ผลิตชีวเคมีที่เกิดในสิ่งมีชีวิต มาประยุกต์ใช้ทางอุตสาหกรรม เพื่อให้เกิดผลิตภัณฑ์ที่ก่อให้เกิดประโยชน์สมบูรณ์ เทคโนโลยีชีวภาพตั้งอยู่บนรากฐานความรู้ทางด้านชีววิทยา เคมี ฟิสิกส์ คณิตศาสตร์ คอมพิวเตอร์ ชีววิทยาของเซลล์ ชีวเคมี จุลชีววิทยา และวิศวกรรมแนวต่าง ๆ จากความรู้พื้นฐานเหล่านี้ ก่อให้เกิดการพัฒนาความรู้ใหม่ เช่น พันธุวิศวกรรม จีโนมิกส์ โปรตีโอมิกส์ และวิศวกรรมเนื้อเยื่อ ทาให้เกิดการพัฒนาเทคโนโลยีชีวภาพที่นาไปใช้ให้เกิดประโยชน์กับมนุษย์ในด้านต่าง ๆ เช่น เทคโนโลยีชีวภาพการเกษตร เทคโนโลยีชีวภาพการแพทย์ เทคโนโลยีชีวภาพสิ่งแวดล้อม และเทคโนโลยีชีวภาพการอาหาร เป็นต้น จุดสาคัญที่ทาให้เทคโนโลยีชีวภาพมีการพัฒนา คือความรู้ทางด้านพันธุวิศวกรรม ซึ่งหมายถึง การดัดแปลงพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิต ทาให้เกิดสิ่งมีชีวิตที่มีลักษณะตามที่มนุษย์ต้องการ สาหรับในประเทศไทยมีการจัดตั้งองค์กรที่เกี่ยวข้องโดยตรงกับการพัฒนาเทคโนโลยีชีวภาพ ได้แก่ ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ ทาให้ประเทศไทยมีความสามารทางด้านความรู้และงานวิจัยที่ทัดเทียมกับต่างประเทศ
คำถามทบทวน
1. อธิบายความหมายเทคโนโลยีชีวภาพมาให้เข้าใจ
2. เทคโนโลยีชีวภาพสมัยเก่าใช้ความรู้ทางด้านใดเป็นสาคัญ
3. เทคโนโลยีชีวภาพสมัยใหม่แตกต่างอย่างไรกับเทคโนโลยีชีวภาพสมัยใหม่
4. ยกตัวอย่างนักวิทยาศาสตร์ที่มีความสาคัญต่อการพัฒนาเทคโนโลยีชีวภาพ
5. ความรู้พื้นฐานที่จาเป็นต่อเทคโนโลยีชีวภาพได้แก่อะไรบ้าง
6. อธิบายการนาความรู้ทางเทคโนโลยีชีวภาพจุลินทรีย์ไปแก้ปัญหาเรื่องการขาดแคลนพลังงาน
7. งานวิจัยทางเทคโนโลยีชีวภาพในปัจจุบันมีการศึกษาเรื่องใดบ้าง
8. จงยกตัวอย่างการแบ่งสาขาเทคโนโลยีชีวภาพตามการประยุกต์ใช้
9. หน่วยงานหลักที่เกี่ยวข้องกับการพัฒนาเทคโนโลยีชีวภาพในประเทศไทย ได้แก่หน่วยงานใด
10. แนวทางการพัฒนาประเทศไทยโดยใช้เทคโนโลยีชีวภาพ ระหว่างปี พ.ศ. 2547 – 2554 มีรายละเอียดอย่างไร
เอกสารอ้างอิง
มาลี สุวรรณอัตถ์, 2527. รายงานการสัมมนาทางวิชาการเรื่อง เทคโนโลยีชีวภาพ : ปัจจุบันและอนาคต. กรุงเทพ: กรมวิชาการเกษตร กระทรวงเกษตรและสหกรณ์.
สถาบันวิจัยวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งประเทศไทย (2544). วิทยาศาสตร์สาหรับเยาวชน “เทคโนโลยีชีวภาพใกล้ตัว 1”. กรุงเทพ : โรงพิมพ์สุรวัฒน์.
สถาบันวิจัยวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งประเทศไทย (2546). ประวัติวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีไทย. พิมพ์ครั้งที่ 2. กรุงเทพ : ศรีเมืองการพิมพ์.
อาสาฬห์ จิตรแจ่ม และเอกดนัย กอกิมพงษ์. (2547). กรอบนโยบายเพื่อการพัฒนาเทคโนโลยีชีวภาพของประเทศ. วารสาร LAB. TODAY 3(19): 68- 73.
Barhum, R.S. (2005). Biotechnology An Introduction. (2nd). United States of America: Thomson Brookslcole. USA.
Brins, W. , (2004) . Biotechnology from A to Z . (3 rd) . United States of America: Oxford university press .
Schmidt, R.D. (2003). Pocket guide to biotechnology and genetic engineering. Germany: Wiley-VCH.
William, T.J. and Michale, P.A. (2004). Introduction to Biotechnology. United States of America: Pearson. Benjamin Cumming.
www.biotec.or.th
บทที่ 2
เทคโนโลยีชีวภาพระดับเซลล์
ความรู้พื้นฐานที่สาคัญในเทคโนโลยีชีวภาพ จะเริ่มต้นจากการเรียนรู้พื้นฐานของสิ่งมีชีวิตทุกชนิด ที่เรียกว่าเซลล์ เมื่อเข้าใจอย่างท่องแท้แล้วก็ต้องศึกษา รายละเอียดการทางานของเซลล์ที่ถูกควบคุมโดยสารพันธุกรรม โดยแสดงออกมาในรูปของโปรตีนหรือเอนไซม์ เพื่อทาหน้าที่ในการควบคุมปฏิกิริยาชีวเคมี ที่เกิดขึ้นในเซลล์ ซึ่งเรียกว่า เมตาบอลิซึม เมตาบอลิซึมของเซลล์จะเป็นหัวใจสาคัญในการผลิตสารต่างๆ ที่นามาใช้งานทางเทคโนโลยีชีวภาพ
2.1 เซลล์
เซลล์ (cell) หมายถึง หน่วยที่เล็กที่สุดของสิ่งมีชีวิต เซลล์มี 2 ประเภท ได้แก่ เซลล์โปรคารีโอติก (procaryotic cell) เป็นเซลล์ที่ไม่มีนิวเคลียส ได้แก่ แบคทีเรีย (bacteria) และสาหร่ายสีเขียวแกมน้าเงิน (blue green algae) ส่วนเซลล์ยูคารีโอติก (eucaryotic cell) เป็นเซลล์ที่มีนิว-เคลียส ได้แก่ เซลล์พืช (plant cell) เซลล์สัตว์ (animal cell) และฟังก์ใจ (fungi) (ภาพที่ 2.1)
ภาพที่ 2.1 ตัวอย่างเซลล์ประเภทต่าง ๆ (A) เซลล์โปรคารีโอติก (B) เซลล์ยูคารีโอติก
ที่มา (Hayes & Reichsman, 2010, p. 3)
ในทางเทคโนโลยีชีวภาพเซลล์ทั้งโปรคารีโอติกและยูคารีโอติก มีความสาคัญเปรียบเป็นเหมือนตัวโรงงานอุตสาหกรรมที่จะใช้ผลิตผลิตภัณฑ์ (product) ที่ต้องการโดยการใส่คำสั่งที่ต้องการลงไปในเซลล์ คาสั่งดังกล่าวคือ ดีเอ็นเอ (DNA) ซึ่งเปรียบเหมือนกับผู้จัดการโรงงานนั่นเอง เมื่อพิจารณาถึงระยะเวลาที่ใช้ในการผลิต เซลล์โปรคารีโอติก จะใช้เวลาในการผลิตสารที่ต้องการในระยะสั้น เช่น แบคทีเรีย ทีมีชั่วรุ่นหนึ่งไปยังอีกชั่วรุ่นหนึ่งเป็นเวลา 20 นาที แต่เมื่อคานึงถึงคุณภาพของโปรตีนที่ผลิตให้ใกล้เคียงกับ มนุษย์ เช่น ผลิตฮอร์โมนอินซูลิน ก็ควรเลือกใช้เซลล์ยูคารีโอติก เป็นต้น
2. 2 โครงสร้างสารพันธุกรรม
จากความเจริญก้าวหน้าทางด้านชีววิทยา ก่อให้เกิดคาถามมากมายที่เกี่ยวข้องกับสิ่งมีชีวิต จนได้บทสรุปว่า สิ่งมีชีวิตย่อมเกิดมาจากสิ่งมีชีวิต (biogenesis) จากข้อสรุปนี้ก่อให้เกิดการค้นคว้าและวิจัยต่อมาในเรื่องพันธุศาสตร์ระดับโมเลกุล ได้มีนักวิทยาศาสตร์หลายท่านที่คิดค้นเรื่องของสารพันธุกรรมที่ควบคุมลักษณะของสิ่งมีชีวิตชนิดต่างๆในธรรมชาติ ดังการเริ่มต้นของการทดลองที่มีความสาคัญคือ นักวิทยาศาสตร์ที่มีชื่อว่า เอฟ กริฟฟิท (F. Griffith) ในปี ค.ศ. 1928 ได้ทดลองเกี่ยวกับปรากฏการณ์ที่เรียกว่ากระบวนการทรานสฟอร์เมชัน (transformation) ซึ่งเกิดจากการนาเซลล์จุลินทรีย์พวกแบคทีเรีย Streptococcus pneumoniae ที่เป็นสายพันธุ์ S ซึ่งก่อให้เกิดโรคปอดบวมที่ผ่านความร้อน (ไม่มีชีวิต) มารวมกับเซลล์แบคทีเรีย Streptococcus pneumoniae สายพันธุ์ R ที่ไม่ก่อโรคปอดบวม (มีชีวิต) ฉีดเข้าไปสู่หนูทดลอง ผลการทดลองพบว่าหนูทดลองตายด้วยโรคปอดบวมเมื่อเจาะเลือดหนูออกมาเพาะเชื้อพบว่ามีแต่แบคทีเรีย Streptococcus pneumoniae สายพันธุ์ S เท่านั้น จึงสรุปการทดลองได้ว่าเซลล์แบคทีเรียที่ตายแล้วสามารถถ่ายทอดข้อมูลทางพันธุกรรมไปยังเซลล์ที่มีชีวิตได้โดยผ่านทางสารพันธุกรรมซึ่งตอนนั้นเรียกว่าทรานสฟอร์มิ่ง แฟกเตอร์ (transforming factor) (ภาพที่ 2.2)
ภาพที่ 2.2 การทดลองของนักวิทยาศาสตร์ที่มีชื่อว่า เอฟ กริฟฟิท ในปี ค.ศ. 1928
ที่มา (weaver, 2000, p. 18) 3
ต่อมาได้มีทีมนักวิทยาศาสตร์ 3 ท่านมีชื่อว่า โอ ที อเวอรี (O.T. Avery) เอ็ม แมคคาร์ที (M. MacCarty) และ ซี แมกลอยด์ (C. MacLeod) ในปี ค.ศ. 1944 ได้พิสูจน์การทดลองของ เอฟ กริฟฟิท โดยทาการสกัดสารดีเอ็นเอจากเซลล์แบคทีเรีย Streptococcus pneumoniae สายพันธุ์ S มาใส่รวมกับเซลล์แบคทีเรีย Streptococcus pneumoniae สายพันธุ์ R ทาให้เกิดการเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์แบคทีเรีย Streptococcus pneumoniae สายพันธุ์ S จากผลการทดลองจึงสรุปได้ว่าสารพันธุกรรม คือ สารดีเอ็นเอ (ภาพที่ 2.3)
ภาพที่ 2.3 การทดลองของนักวิทยาศาสตร์ที่มีชื่อว่า
โอ ที อเวอรี เอ็ม แมคคาร์ที และ ซี แมกลอยด์ ในปี ค.ศ. 1944
ที่มา (Mix et al., 1996, p. 321)
จากนั้นก็ได้มีการทดลองของนักวิทยาศาสตร์อีกมากมายในที่สุดทาให้เกิดการค้นพบโครงสร้าง ดีเอ็นเอ ที่สมบูรณ์แบบโดยนักวิทยาศาสตร์ 2 ท่าน คือ เจ วัตสัน (J. watson) และ เอฟ คริก (F. Crick) ในปี ค.ศ. 1953 ซึ่งจะอธิบายในหัวข้อต่อไป
สารพันธุกรรม (genetic material) หรือกรดนิวคลีอิก (nucleic acid) คือ โพลีนิวคลีโอไทด์ (polynucleotide) ซึ่งหมายถึง นิวคลีโอไทด์หลายๆตัวมาต่อกัน ส่วนประกอบของนิวคลีโอไทด์แต่ละตัวมีลักษณะที่แตกต่างกัน ก่อให้เกิดกรดนิวคลีอิกมีลักษณะแตกต่างกัน 2 ชนิด ได้แก่ ดีเอ็นเอ4
(DNA : Deoxyribonucleic acid) และ อาร์เอ็นเอ (RNA : Ribonucleic acid) ดังรายละเอียดขององค์ประกอบในนิวคลีโอไทด์ซึ่งมีส่วนประกอบ 3 ส่วน(ภาพที่ 2.4) ได้แก่
1) น้าตาล (sugar) ในกรดนิวคลีอิก มีน้าตาลที่มีคาร์บอน 5 อะตอม (pentose) 2 แบบ ได้แก่ น้าตาลดีออกซีไรโบส (deoxyribose) ซึ่งพบเฉพาะในดีเอ็นเอ และน้าตาลไรโบส (ribose) ซึ่งพบเฉพาะในอาร์เอ็นเอ
2) เบส (base) ซึ่งเป็นเบสที่มีสารประกอบของไนโตรเจน (nitrogenous base) มี 2 กลุ่ม ได้แก่ เบสพิวรีน (purine) มีโครงสร้างเป็นวงแหวน 2 วง มี 2 ชนิด คือ อะดินีน (adenine : A) และกัวนีน (guanine : G) พบทั้งในดีเอ็นเอและอาร์เอ็นเอ เบสไพริมิดีน (pyrimidine) มีโครงสร้างเป็นวงแหวน 1 วง มี 3 ชนิด คือไซโทซีน (cytosine : C) พบทั้งในดีเอ็นเอและอาร์เอ็นเอ ไทมีน (tymine : T) พบได้ในดีเอ็นเอ และ ยูราซิล (uracil : U) พบเฉพาะในอาร์เอ็นเอ
3) กรดฟอสฟอริก (H3PO4) คือหมู่ฟอสเฟต
นิวคลีโอไทด์จะประกอบด้วยน้าตาลที่บริเวณ C-1 ต่อรวมกันกับเบสพิวรีนตาแหน่งที่ 9 หรือเบสไพริมิดีนตาแหน่งที่ 1 และหมู่ฟอสเฟตจะเกาะกับน้าตาลที่บริเวณ C-5 (ภาพที่ 2.4)แต่ถ้าน้าตาลต่อกับเบสแต่ไม่มีหมู่ฟอสเฟตเรียกว่านิวคลีโอไซด์ (nucleoside) การเรียกชื่อของนิวคลีโอไทด์ จะเรียกชื่อตามชนิดเบสที่เป็นองค์ประกอบและถ้าเป็นน้าตาลชนิดดีออกซีไรโบสก็จะมีคาว่าดีออกซีเพิ่มเข้าไปข้างหน้านิวคลีโอไซด์และนิวคลีโอไทด์เดิม
ภาพที่ 2.4 ส่วนประกอบของนิวคลีโอไทด์
ที่มา (Hartwell et al., 2000, p. 151)
จากที่กล่าวมาข้างต้นเป็นการเรียนรู้ถึงเรื่องนิวคลีโอไทด์แต่ละตัว ขั้นต่อมาคือการนาเอานิวคลีโอไทด์แต่ละตัวมาต่อกันโดยนิวคลีโอไทด์แต่ละตัวจะเชื่อมต่อกันโดยมีหมู่ฟอสเฟตเป็นตัวกลาง หมู่ฟอสเฟต (PO4 3-) ซึ่งต่อกันกับน้าตาลในนิวคลีโอไทด์ตัวที่หนึ่งที่ตาแหน่ง 5, และต่อกับหมู่โอเอช (OH) ซึ่งต่อกันกับน้าตาลในอีกนิวคลีโอไทด์หนึ่งที่ตาแหน่ง 3, เรียกพันธะที่เกิดขึ้นว่าพันธะฟอสฟอไดเอสเทอร์ (phosphodiester bond) ทาให้เกิดเป็นสายที่เรียกว่า พอลีนิวคลีโอไทด์ 1 สาย ที่มีปลาย 5, ฟอสเฟตและปลาย 3, ไฮดรอก-ซิล (ภาพที่ 2.5)
ภาพที่ 2.5 สายพอลีนิวคลีโอไทด์ และโครโมโซม
ที่มา (Renneberg, 2006, pp. 60-64)
โครงสร้างดีเอ็นเอที่เสนอโดยวัตสันและคริกมีลักษณะเป็นเกลียวคู่ (double helix) ซึ่งเกิดจากสายพอลีนิวคลีโอไทด์ 2 สาย (ภาพที่ 2.6) วางขนานกลับทิศทางกัน (antiparallel) สายหนึ่งมีทิศทางจากปลาย 5,ไป 3, อีกสายหนึ่งเป็น 3, ไป 5, แต่ละสายจับกันด้วยพันธะไฮโดรเจน (hydrogen bond ) ระหว่างเบสที่เป็นคู่สมกัน (complementary base) คือ A จับคู่กับ T ด้วยพันธะไฮโดรเจน 2 พันธะ และ G จับคู่กับ C ด้วยพันธะไฮโดรเจน 3 พันธะ จากโครงสร้างและทิศทางของพันธะต่างๆ ในโมเลกุลทาให้สายพอลีนิวคลีโอไทด์ทั้ง 2 สายที่จับกันแบบลักษณะบิดเป็นเกลียวเวียนขวา (right handed helix) คล้ายบันไดเวียน ส่วนของเบสที่จับคู่กันอยู่ภายในคล้ายขั้นบันได หมู่ฟอสเฟต และน้าตาลอยู่ด้านนอกเป็นขอบหรือราวบันได เบสแต่ละคู่อยู่ห่างกัน 3.4 อังสตรอม และบิดเป็นมุมประมาณ 36 องศา เกลียวดีเอ็นเอหมุนไป 1 รอบจะประกอบด้วยเบสประมาณ 10 คู่ ความยาว 34 อังสตรอม เส้นผ่านศูนย์กลางของเกลียวคือ 20 อังสตรอมในสิ่งมีชีวิตชั้นสูง สายดีเอ็นเอจะพันรอบโปรตีน ก่อให้เกิดเป็นลักษณะที่เรียกว่าโครโมโซม (chromosome) (ภาพที่ 2.5) ส่วนอาร์เอ็นเอก็จะเป็นพอลีนิวคลีโอ-ไทด์สายเดี่ยวมีการเชื่อมต่อที่มี่ลักษณะเหมือนกับดีเอ็นเอ ก่อให้เกิดปลาย 5, ฟอสเฟต และปลาย 3, ไฮดรอกซิลเหมือนกัน
ภาพที่ 2.6 โครงสร้างดีเอ็นเอเกลียวคู่ของวัตสันและคริก
ที่มา (Freeman, 2005, p. 82)
2.3 หน้าที่ของสารพันธุกรรม
จากความรู้เรื่องโครงสร้างและองค์ประกอบของสารพันธุกรรมทาให้นักวิทยาศาสตร์ทางด้านพันธุศาสตร์และชีววิทยาระดับโมเลกุลได้ทาการศึกษาเรื่องหน้าที่ของสารพันธุกรรมพบว่ามีหน้าที่สาคัญ 2 ประการ (ภาพที่ 2.7) คือ ประการที่หนึ่ง คือ การเก็บรักษาข้อมูลทางพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิต ในขณะเดียวกันก็มีการถ่ายทอดข้อมูลพันธุกรรมสู่ลูกหลาน โดยผ่านกระบวนการสืบพันธุ์ (reproduction) แบบใช้เพศหรือไม่ใช้เพศ ประการที่สอง คือ ควบคุมการสร้างโปรตีนของสิ่งมีชีวิต โดยผ่านกระบวนการถอดรหัส (transcription) และแปลรหัส (translation) ตามลำดับ
ภาพที่ 2.7 หน้าที่ของสารพันธุกรรม
ที่มา ( Schmid , 2003, p. 219)
2.3.1 การเก็บรักษาข้อมูลทางพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิต
การเก็บรักษาข้อมูลทางพันธุกรรมนั้น สามารถศึกษาได้จากกระบวนการแบ่งเซลล์ร่างกายแบบไมโทซีส (mitosis) ในขั้นตอนเรียกว่าระยะอินเทอร์เฟส (interphase) จะมีการเพิ่มจานวนดีเอ็นเอขึ้นอีกเท่าตัวโดยผ่านกระบวนการจาลองโมเลกุลดีเอ็นเอ (DNA replication) แบบกึ่งอนุรักษ์ (semiconservative) ซึ่งเกิดโดยสายดีเอ็นเอ 2 สายแยกออกจากกัน แล้วทาหน้าที่เป็นต้นแบบ (template) ในการสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่ โดยดีเอ็นเอสายใหม่ที่สร้างขึ้นจะมีเบสเป็นคู่สมกันกับดีเอ็นเอที่เป็นต้นแบบ ทาให้ได้โมเลกุลดีเอ็นเอที่เหมือนเดิมทุกประการ โดยดีเอ็นเอที่เกิดขึ้นมาประกอบด้วย พอลินิวคลีโอไทด์สายเดิม 1 สาย จับกับสายดีเอ็นเอที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่ 1 สาย ถ้าเริ่มต้นด้วยดีเอ็นเอ 2 เส้น ทาหน้าที่เป็นแม่พิมพ์ สายดีเอ็นเอที่เกิดขึ้นใหม่ 2 เส้น จะมีชื่อเรียกที่แตกต่างๆกัน คือ สายดีเอ็นเอนา (leading strand) และสายดีเอ็นเอตาม (lagging strand) เนื่องจากการทางานของเอนไซม์ ดีเอ็นเอ พอลิเมอเรส (DNA polymerase) ที่ทาหน้าที่สังเคราะห์ดีเอ็นเอโดยนานิวคลีโอไทด์เข้ามาต่อในทิศทาง 5, ไป 3, ของนิวคลีโอไทด์สายใหม่ กระบวนการจาลองโมเลกุลของดีเอ็นเอเริ่มจากเอนไซม์เฮลิเคส (helicase) ทาหน้าที่สลายพันธะไฮโดรเจน เพื่อทาให้สายดีเอ็นเอที่เป็นสายคู่แยกออกจากกันเป็นสายเดี่ยว จากนั้นโปรตีน SSB (single strand binding protein) จะเข้าไปจับเพื่อป้องกันไม่ให้สายดีเอ็นเอกลับมาจับกันเป็นสายคู่อีก จากนั้นเอนไซม์โทโปไอโซเมอเรส (topoisomerase) จะคลายปมที่อยู่เหนือรอบแยกโดยตัดสายดีเอ็นเอหนึ่งออกเพื่อให้คลายเกลียวออก แล้วจึงต่อกลับเข้าดังเดิม บริเวณที่มีการคลายเกลียวของดีเอ็นเอนั้นเป็นจุดเริ่มต้นของการสังเคราะห์ ดีเอ็นเอสายใหม่ โดยเอนไซม์ไพรเมส (primase) จะสังเคราะห์สายดี-เอ็นเอไพรเมอร์ (primer) เป็นจุดเริ่มต้นในทิศทาง 5 , ไป 3, เข้าคู่กับดี-เอ็นเอสายต้นแบบที่มีทิศทาง 3, ไป 5, แล้วเอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส III จึงทาหน้าที่เติมนิวคลีโอไทด์เข้าที่ปลาย 3, ของสายอาร์เอ็นเอไพรเมอร์ ไปเรื่อยๆ สายที่มีทิศทางการสร้างเป็นไปตามทิศทางการคลายเกลียวจะได้เส้นดีเอ็นเอที่ต่อเนื่องเรียกว่าสายนาส่วนอีกสายดีเอ็นเอหนึ่งที่มีทิศทางตรงข้ามจะได้สายดีเอ็นเอสั้นๆไม่ต่อเนื่อง เมื่อมีการคลายเกลียวต่อไปอีกจะมีการสร้างไพรเมอร์ใหม่ และเอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส III จะนำนิวคลีโอไทด์มาต่อทาให้ได้สายสั้นๆ เรียกว่าเส้นโอคาซากิ (Okazaki fragment) มีความยาวประมาณ 1000 – 2000 นิวคลีโอไทด์เส้นโอคาซากิจะเชื่อมต่อกันได้โดยเอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส I จะตัดสายอาร์เอ็นเอไพรเมอร์ออกโดยตัดจากปลาย 5, และจะเติมนิวคลีโอไทด์เข้าที่ปลาย 3, ของเส้นที่อยู่ถัดขึ้นมาต่อจากที่เอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิ-เมอเรส III สังเคราะห์ไว้ทาให้อาร์เอ็นเอไพรเมอร์ค่อยๆถูกตัดออกทีละ 1 นิวคลีโอไทด์ จากปลาย 5, ขณะเดียวกันปลาย 3, ส่วนที่เป็นดีเอ็นเอก็ค่อยๆ ยาวเพิ่มขึ้น จนมีการแทนที่อาร์เอ็นเอไพรเมอร์ด้วยดีเอ็นเอทั้งหมด แล้วเอนไซม์ดีเอ็นเอไลเกส (ligase) จึงมาเชื่อมช่องว่างโดยการสร้างพันธะฟอสโฟไดเอสเทอร์เชื่อมระหว่างเส้นโอคาซากิทั้งสองได้เป็นสายดีเอ็นเอตาม (ภาพที่ 2.8)
ภาพที่ 2.8 กระบวนการจาลองโมเลกุลดีเอ็นเอ
ที่มา (Wallace et al., 1996, p. 269)
2.3.2 ควบคุมการสร้างโปรตีนของสิ่งมีชีวิต
จากการศึกษาทางด้านพันธุศาสตร์ระดับโมเลกุล พบว่าดีเอ็นเอทาหน้าที่กาหนดชนิดโปรตีนโดยผ่านกระบวนการถอดรหัสเป็นอาร์เอ็นเอ (transcription) แล้วตามด้วยกระบวนการแปลรหัสเป็นโปรตีน (translation) (ภาพที่ 2.9) อาร์เอ็นเอที่ทาหน้าที่นารหัสมาจากดีเอ็นเอมาแปลเป็นโปรตีน คือ เอ็มอาร์เอ็นเอ (mRNA) ส่วนทีอาร์เอ็นเอ (tRNA) ทาหน้าที่นาวัตถุดิบคือกรดอะมิโนมายังแหล่งสังเคราะห์โปรตีน คือ ไรโบโซม (ribosome) ซึ่งประกอบด้วยอาร์อาร์เอ็นเอ (rRNA) และโปรตีนหลายชนิดมารวมกัน ไรโบโซมมี 2 หน่วยย่อย คือหน่วยที่มีขนาดใหญ่และขนาดเล็ก การสังเคราะห์โปรตีน เริ่มจากเอ็มอาร์เอ็นเอ ที่ถอดรหัสมาจากดีเอ็นเอเคลี่อนที่จากนิวเคลียสมาสู่ ไซโทพลาสซึม (cytoplasm) ต่อจากไรโบโซมหน่วยเล็กก็จะเข้ามาจับกับเอ็มอาร์เอ็นเอ การแปลรหัสจากโปรตีนจะเริ่มต้นจากปลาย 5’ของเอ็มอาร์เอ็นเอ ที่รหัส AUG (initiation codon) ซึ่งเป็นรหัสสาหรับกรดอะมิโน เมไทโอนีนเสมอ โดยการนามาของทีอาร์เอ็นเอ ที่มีแอนติโคดอน (anticodon) เป็น UAC แล้วไรโบโซมหน่วยใหญ่จึงมาจับตัวกับหน่วยเล็กเพื่อให้ เอ็มอาร์เอ็นเอ และทีอาร์เอ็นเอ จับตัวกันดีขึ้น จากนั้นจึงมี ทีอาร์เอ็นเอตัวที่สองนากรดอะมิโนตัวใหม่เข้ามาจับที่โคดอนที่สอง เมื่อทีอาร์เอ็นเอตัวที่สองนากรดอะมิโนตัวที่สองมาจับกับเอ็มอาร์เอ็นเอแล้วจะเกิดพันธะเปปไทด์ระหว่างกรดอะมิโนตัวที่หนึ่งและสอง ทาให้ทีอาร์เอ็นเอตัวที่ 1 เป็นอิสระ และหลุดออกจากการเกาะจับกับเอ็มอาร์เอ็นเอ พร้อมกันนั้นก็มีการเคลื่อนที่ของไรโบโซมไปทางด้านปลาย 3’ ของเอ็มอาร์เอ็นเอ ไปยังโคดอนถัดไป ทีอาร์เอ็นเอตัวต่อมาจะนากรดอะมิโนมาสู่ เอ็มอาร์เอ็นเอ ตามลาดับโคดอนและเกิดพันธะเปปไทด์ไปเรื่อย ๆ จนได้สายพอลิเปปไทด์ เมื่อไรโบโซมเคลื่อนที่มาถึงรหัสหยุด UAA หรือ UAG หรือ UGA ซึ่งเป็นรหัสหยุด การสังเคราะห์โปรตีนจะจบลงโดยสายพอลิเปปไทด์ที่ได้หลุดออกจาก ทีอาร์เอ็นเอตัวสุดท้าย ไรโบโซมแยกเป็นหน่วยย่อย และหลุดออกจากเอ็มอาร์เอ็นเอ ทาให้ได้เป็นโปรตีน ซึ่งก็คือพอลิเปปไทด์ นั่นเอง (ภาพที่ 2.9) ถ้ามีการเปลี่ยนแปลงในระดับรหัสพันธุกรรม หรือมีการแตกหักเสียหายของโครโมโซมจะก่อให้เกิดกระบวนการกลาย (mutation)
ภาพที่ 2.9 กระบวนการสังเคราะห์โปรตีน
ที่มา (Solomon et al., 1996, p. 290)
2.4 เมตาบอลิซึม
ในช่วงเวลา 4000 ล้านปี สิ่งมีชีวิตได้กาเนิดบนโลก หลักการพื้นฐานที่สาคัญข้อหนึ่งของสิ่งมีชีวิตคือ เมตาบอลิซึม (metabolism) ซึ่งหมายถึงปฏิกิริยาชีวเคมีที่เกิดขึ้นในสิ่งมีชีวิตมีสองประเภทใหญ่ ๆ ได้แก่ ปฏิกิริยาการสร้าง (anabolism) ปฏิกิริยาการทาลาย (catabolism) เมตาบอลิซึมมีจุดแตกต่างหลักอยู่สองจุดที่สาคัญคือ กลุ่มสิ่งมีชีวิตที่สังเคราะห์อาหารได้เอง (autotrophic organism) สามารถใช้คาร์บอนไดออกไซด์เป็นแหล่งคาร์บอน และ กลุ่มสิ่งมีชีวิตที่ไม่สังเคราะห์อาหารได้เอง (heterotrophic organism) ต้องใช้สารอินทรีย์ (organic compound) เพื่อการเจริญเติบโต หรืออาจะแบ่งกลุ่มสิ่งมีชีวิตโดยดูจากเจริญเติบโตในภาวะที่มีหรือไม่มีออกซิเจน ในรายละเอียดของเมตาบอลิ-ซึม อาจจะดูถึงวิถี (pathway) ไกลโคไลซิสหรือเพนโทสฟอสเฟต ซึ่งทาให้เข้าใจความเป็นอยู่ของสิ่งมีชีวิตในสภาวะแวดล้อมต่างๆ รวมถึงเข้าใจกลไกการควบคุมการทางานเป็นร่างแห (network) และจาลองสภาวะต่างๆของสิ่งมีชีวิตในคอมพิวเตอร์ (silico) ในทางเทคโนโลยีชีวภาพ เมตาบอลิซึมเป็นกุญแจสาคัญในการเพิ่มผลผลิต (product) การกาจัดผลิตภัณฑ์ที่ไม่ต้องการ (by product) ตลอดจนถึงเป็นฐานที่สาคัญในกระบวนการพันธุวิศวกรรม
ออโตโทรฟิท เมตาบอลิซึม (autotrophic metabolism) หรือสิ่งมีชีวิตที่สังเคราะห์อาหารได้เอง สามารถใช้คาร์บอนไดออกไซด์เป็นแหล่งคาร์บอน สิ่งมีชีวิตพวกนี้ได้แก่ พืช (plant) สาหร่าย (algae) และสาหร่ายสีเขียวแกมน้าเงิน (cyanobacteria) สามารถจับพลังงานจากแสงโดยใช้ โฟโตรีแอคชัน เซนเตอร์ (photoreaction center) เปลี่ยนเป็นพลังงานเคมี เก็บไว้ในรูป เอทีพี (ATP, adenosine triphosphate) นอกจากสิ่งมีชีวิตกลุ่มนี้แล้วยังมีกลุ่มที่เรียกว่า ลิโทรโตรฟิท (lithotrophic organism) สามารถได้พลังงานจากการย่อยสารอนินทรีย์ (inorganic compound) เช่น ซัลเฟอร์ ไนโตรเจน เหล็ก เป็นต้น เช่น ไนตริไฟอิง แบคทีเรีย (nitrifying bacteria) และ ไทโอบาซิลลัส (thiobacillus)
เฮทเทอโรโทรฟิท แอนแอโรบิก เมตาบอลิซึม (herterotrophic anaerobic metabolisn) เป็นกลุ่มสิ่งมีชีวิตที่ไม่สังเคราะห์อาหารได้เอง และใช้ประโยชน์ทางเทคโนโลยีชีวภาพ ในการผลิตเอทา-นอล อะซีโตน 1-บิวทานอลและกรดแลกติก สามารถได้พลังงานเอทีพีจากการทากระบวนการคะตะ-บอไลซ์น้าตาลกลูโคส นอกจากนี้ยังมีกลุ่มแบคทีเรียโบราณที่สร้างมีเทน (methane – forming archaea) ซึ่งใช้ประโยชน์ในการบาบัดน้าเสียโดยไม่ใช้อากาศ (anaerobic sludge treatment)
เฮทเทอโรโทรฟิท แอโรบิก เมตาบอลิซึม (herterotrophic aerobic metabolisn) เป็นกลุ่มจุลินทรีย์ที่ใช้ประโยชน์ทางเทคโนโลยีชีวภาพมาก มีการผลิตพลังงานโดยผ่านกระบวนการหายใจระดับเซลล์แบบใช้ออกซิเจน ซึ่งมีแกนหลักเป็น วัฏจักรกรดซิตริก (citric acid cycle) ให้พลังงาน 36 เอทีพี/กูลโคส 1 โมลและเกิดผลิตภัณฑ์ได้หลายอย่าง เช่น กรดซิตริก กรดกลูตามิก (glutamic acid) (ภาพที่ 2.10)
ภาพที่ 2.10 วัฏจักรกรดซิตริกและผลิตสารเมตาบอไลต์ทุติยภูมิ
ที่มา ( Schmid , 2003, p. 271)
เมตาบอไลต์ทุติยภูมิ (secondary metabolite) สิ่งมีชีวิตสามารถสร้างสารเมตาบอไลซ์ที่ไม่เกี่ยวข้องกับการเจริญของเซลล์เรียกว่าเมตาบอไลซ์ทุติยภูมิ ในพืช เมตาบอไลซ์ทุติยภูมิมีความสาคัญในการต่อต้านเชื้อโรค และการทาลายจากแมลง ในจุลินทรีย์เมตาบอไลซ์ทุติยภูมิได้แก่ ยาปฏิชีวนะแอนติไบโอติก (antibiotics) (ภาพที่ 2.10)
2.5 กระบวนการหายใจระดับเซลล์
กระบวนการหายใจระดับเซลล์ (cellular respiration) เป็นกระบวนการเมตาบอลิซึมที่เกี่ยวข้องกับวิถี (pathway) การทาลายสารอินทรีย์ (catabolism) เพื่อผลิตพลังงานและสารประกอบขนาดเล็ก นาไปใช้ในการดารงชีวิตและการเจริญเติบโตของเซลล์ กระบวนการหายใจระดับเซลล์มีขั้นตอนที่เกี่ยวข้อง 3 ขั้นตอน ได้แก่ วิถีไกลโคไลซิส (glycolysis pathway) วัฏจักรกรดซิตริก (citric acid cycle) และ การถ่ายทอดอิเล็กตรอน (electron transport chain)
2.5.1 วิถีไกลโคไลซิส
วิถีไกลโคไลซิส (glycolysis pathway) หรือที่เรียกอีกชื่อว่า วิถีเอมเดน ไมออฟ (Embden – Meyerhof pathway) เป็นขั้นตอนแรกของกระบวนการหายใจระดับเซลล์ ที่เกี่ยวข้องกับการทาลายสารประกอบคาร์โบไฮเดรท (carbohydrate) เช่น น้าตาล กูลโคส (glucose) (ภาพที่ 2.11)
ภาพที่ 2.11 กระบวนการหายใจระดับเซลล์
ที่มา (Mader, 1994, p. 51)
วิถีไกลโคไลซิส จะเกิดขึ้นในไซโตพลาสซึม (cytoplasm) ของเซลล์ และถ้าจะเกิดการเปลี่ยนแปลงในขั้นต่อไปก็จะขึ้นกับออกซิเจน ถ้าไม่มีออกซิเจน จะเกิดการหายใจแบบไม่ใช้ออกซิเจน(anaerobic respiration) เรียกสภาวะแบบนี้ว่า การหมัก (fermentation) เกิดในภาวะที่ไม่มีออกซิเจน NADH + H+ จะถูกออกซิไดซ์กลับไปเป็น NAD+ โดยใช้กรดไพรูวิก เป็นตัวรับอิเล็กตรอนและโปรตอน กระบวนการนี้ก่อให้เกิดการสังเคราะห์เอทีพี ก่อให้เกิดผลิตภัณฑ์ เช่น กรดแลกติก (lactic acid) หรือ เอทิลแอลกอฮอล์ (ethyl alcohol) เป็นต้น แต่ถ้าเซลล์อยู่ในภาวะที่มีออกซิเจนจะเกิดการหายใจแบบใช้ออกซิเจน (aerobic respiration) ดังสมการ
Glucose + 2ADP+ + 2Pi + 2NAD+ ———--> 2 Pyruvate + 2ATP+ 2NADH + 2 H+
จากสมการจะเห็นว่าในวิถีไกลโคไลซิสจะเกิดสารอินทรีย์พลังงานสูงที่เรียกว่า อะดีโนซีนไตรฟอสเฟต (adenosine triphosphate , ATP) ที่ใช้เป็นสารที่ให้พลังงานแก่เซลล์หรือใช้ในการเร่งปฏิกิริยาชีวเคมีต่างๆในสิ่งมีชีวิต ส่วน NADH + H +ก็จะถูกเปลี่ยนเป็นสารอินทรีย์พลังงานสูง โดยกระบวนการออกซิเดตีฟ ฟอสฟอรีเลชัน (oxidative phosphorylation) ในขั้นตอนการถ่ายทอดอิเล็กตรอน กรดไพรูวิก (pyruvic acid) ที่เกิดจากวิถีไกลโคไลซิส สามารถเปลี่ยนเป็นสารอื่นต่อไปเพื่อผลิตพลังงาน ในภาวะที่มีออกซิเจนโดยผ่านกระบวนการทีเรียกว่า วัฏจักรกรดซิตริก
2.5.2 วัฏจักรกรดซิตริก
วัฏจักรกรดซิตริก (citric acid cycle) หรืออาจจะเรียกอีกชื่อหนึ่งว่า วัฏจักรกรดไตรคารบอกซีลิก (tricarboxylic acid cycle) หรือวัฏจักรเครปส์ (kerb ‘s cycle) จะเกิดขึ้นต่อจากวิถีไกลโคไลซิส เมื่อเซลล์อยู่ในภาวะที่มีออกซิเจน ทาให้เกิดการเปลี่ยนแปลงกรดไพรูวิก โดยกระบวนการออกซิเดชัน (oxidation) ให้กลายเป็น กาซ์คาร์บอนไดออกไซด์ (ภาพที่ 2.11) กรดไพรูวิกจะไม่สามารถผ่านเข้าสู่วัฏจักรกรดซิตริกได้โดยตรงแต่จะต้องเปลี่ยนเป็นสารที่เรียกว่า อะซิลทิลโคเอ (acetyl CoA) ดังสมการ
Pyruvate + NAD+ + CoA ———--> Acetyl CoA + NADH + H +
ในการเปลี่ยนแปลงดังสมการข้างต้นใช้เอนไซม์ ไพรูเวต ดีไฮโดรจีเนส (pyruvate dehydrogenase) ที่อยู่ในเซลล์ สาหรับอะซิลทิลโคเอ สามารถที่จะเกิดจากกระบวนการเปลี่ยนแปลงไขมัน (lipid) และกรดอะมิโน (amino acid) ได้อีกด้วย ในวัฏจักรกรดซิตริกนี้จะมีการผลิตพลังงานมากที่สุดโดยผ่านสารตัวกลางพวก NADH + H + แล้วนาไปถ่ายทอดอิเล็กตรอน ได้เป็นพลังงานในรูปสารอินทรีย์พลังงานสูง
2.5.3 การถ่ายทอดอิเล็กตรอน
การถ่ายทอดอิเล็กตรอน (electron transport chain) เป็นการนาสาร NADH + H + และ FADH2 ซึ่งเกิดจากกระบวนการหายใจระดับเซลล์ในหัวข้อ 2.5.1-2.5.2 ถูกเปลี่ยนเป็นสารอินทรีย์พลังงานสูงที่เรียกว่า เอทีพี (ATP) โดยผ่านการถ่ายทอดอิเล็กตรอน ทีมีสารตัวรับอิเล็กตอน (electron acceptor)ต่างๆ จนถึง ออกซิเจนที่เป็นตัวรับอิเล็กตรอนตัวสุดท้าย กระบวนการนี้จะเกิดในเยื่อหุ้มชั้นใน (inner membrane) ของอวัยวะในเซลล์ที่มีชื่อว่า ไมโทคอนเดรีย (mitochondria) (ภาพที่ 2.11)
กระบวนการถ่ายทอดอิเล็กตรอนเป็นปฏิกิริยาออกซิเดชัน (oxidation) และรีดักชัน(reduction) หรือที่เรียกรวมกันว่า ปฏิกิริยา รีดอกซ์ (redox reaction) ซึ่งมีความสัมพันธ์กับไฮโดรเจนโดยศักยภาพรีดอกซ์ (redox potential) ในทางบวกจะบ่งชี้สารประกอบที่มีสัมพันธภาพ (affinity) มาก สามารถที่จะรับอิเล็กตรอนจากไฮโดรเจน ส่วนค่าศักยภาพรีดอกซ์ในทางลบ จะบ่งชี้ถึงสัมพันธภาพที่น้อยและโมเลกุลจะให้อิเล็กตรอนสู่ไฮโดรเจน ความแตกต่างของค่าศักยภาพรีดอกซ์ของ NADH + H+/NAD+ เท่ากับ – 0.32 โวลต์ ส่วน O 2 / H2O เท่ากับ +0.82 โวลต์ ทาให้เกิดการเคลื่อนที่ของอิเล็กตรอนจากตัวให้อิเล็กตรอนสู่ตัวรับอิเล็กตรอน หรือจากค่าศักยภาพรีดอกซ์ลบไปยังค่าบวก พลังงานจะถูกปลดปล่อยจากอิเล็กตรอนที่เคลื่อนที่ไปยังตัวรับ ถ้าพลังงานที่ปลดปล่อยมีจานวนมากสามารถที่จะก่อให้เกิดการเคลื่อนที่ของไฮโดรเจนอิออน ผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ สามารถทาให้เกิด สารเอทีพี
เมื่อ NADH + H+ เป็นตัวให้อิเล็กตรอนและออกซิเจนเป็นตัวรับอิเล็กตรอนตัวสุดท้าย โปรตอนจะเคลื่อนที่ 3 บริเวณ ซึ่งมีความสัมพันธ์กับการเปลี่ยนแปลงพลังงาน บริเวณที่เกี่ยวกับ เอ็นเอดีเอช ดีไฮโดรจีเนส (NADH dehydrogenase) ไซโตโครม บีซี 1 (cytochrome bc1) และบริเวณเทอมินอล ทรานสเฟอเรส ( terminal transferase oxidase) การปั้มไฮโดรเจนอิออน ข้ามผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ออกสู่ภายนอก จะผลิต โปรตอน โมทีฟ ฟรอส (proton motive force , PMF) เมื่อ ไฮโดรเจนจะกลับเข้าสู่ภายใน จะใช้พลังงานที่จะสังเคราะห์ เอทีพี โดยใช้ เอทีพี ซินเทส (ATP synthase , ATPase) (ภาพที่ 2.12)
ภาพที่ 2.12 การสร้างเอทีพี
ที่มา (Lodish et al., 2000, p. 646) 16
บทสรุป
เซลล์ หมายถึง หน่วยที่เล็กที่สุดของสิ่งมีชีวิต เซลล์มี 2 ประเภท ได้แก่ เซลล์โปรคารีโอติก เป็นเซลล์ที่ไม่มีนิวเคลียส ได้แก่ แบคทีเรีย และสาหร่ายสีเขียวแกมน้าเงิน ส่วนเซลล์ยูคารีโอติก เป็นเซลล์ที่มีนิวเคลียส ได้แก่ เซลล์พืช เซลล์สัตว์ และฟังก์ใจ เป็นต้น ภายในเซลล์ทุกเซลล์จะมีสารพันธุกรรม หรือกรดนิวคลีอิก กรดนิวคลีอิกมีลักษณะแตกต่างกัน 2 ชนิด ได้แก่ ดีเอ็นเอ และ อาร์เอ็นเอ หน้าที่ของสารพันธุกรรมพบว่ามีหน้าที่สาคัญ 2 ประการคือ ประการที่หนึ่ง คือ การเก็บรักษาข้อมูลทางพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิต สามารถศึกษาได้จากกระบวนการแบ่งเซลล์ร่างกายแบบไมโทซีส ในขั้นตอนเรียกว่าระยะอินเทอร์เฟส จะมีการเพิ่มจานวนดีเอ็นเอขึ้นอีกเท่าตัวโดยผ่านกระบวนการจาลองโมเลกุลดีเอ็นเอแบบกึ่งอนุรักษ์ ในขณะเดียวกันก็มีการถ่ายทอดข้อมูลพันธุกรรมสู่ลูกหลาน โดยผ่านกระบวนการสืบพันธุ์ แบบใช้เพศหรือไม่ใช้เพศ ประการที่สอง คือ ควบคุมการสร้างโปรตีนของสิ่งมีชีวิต โดยผ่านกระบวนการถอดรหัส และแปลรหัสตามลาดับ โปรตีนหรือเอนไซม์ที่ได้จากกระบวนการถอดรหัส และแปลรหัส จะมีส่วนสาคัญในการเกิดปฏิกิริยาชีวเคมีที่เกิดขึ้นในสิ่งมีชีวิตมีสองประเภทใหญ่ ๆ ได้แก่ ปฏิกิริยาการสร้างและปฏิกิริยาการทาลาย ทีรวมเรียกว่า เมตาบอลิซึม ตัวอย่างหนึ่งก็คือ กระบวนการหายใจระดับเซลล์แบบใช้ออกซิเจน เป็นกระบวนการเมตาบอลิซึมที่เกี่ยวข้องกับวิถี การทาลายสารอินทรีย์ เพื่อผลิตพลังงานและสารประกอบขนาดเล็ก นาไปใช้ในการดารงชีวิตและการเจริญเติบโตของเซลล์ กระบวนการหายใจระดับเซลล์แบบใช้ออกซิเจนมีขั้นตอนที่เกี่ยวข้อง 3 ขั้นตอน ได้แก่ วิถีไกลโคไลซิส วัฏจักรกรดซิตริก และ การถ่ายทอดอิเล็กตรอน ในระหว่างขั้นกระบวนการหายใจระดับเซลล์แบบใช้ออกซิเจนช่วงวัฏจักรกรดซิตริก สิ่งมีชีวิตสามารถสร้างสารเมตาบอไลซ์ที่ไม่เกี่ยวข้องกับการเจริญของเซลล์เรียกว่าเมตาบอไลซ์ทุติยภูมิ ในพืช เมตาบอไลซ์ทุติยภูมิมีความสาคัญในการต่อต้านเชื้อโรค และการทาลายจากแมลง ในจุลินทรีย์เมตาบอไลซ์ทุติยภูมิได้แก่ ยาปฏิชีวนะแอนติไบโอติก ซึ่งนามาใช้ประโยชน์ทางเทคโนโลยีชีวภาพ นอกจากนี้ ถ้าไม่มีออกซิเจนจะเกิดการหายใจแบบไม่ใช้ออกซิเจนเรียกสภาวะแบบนี้ว่า การหมัก เกิดในภาวะที่ไม่มีออกซิเจน NADH + H+ จะถูกออกซิไดซ์กลับไปเป็น NAD+ โดยใช้กรดไพรูวิก เป็นตัวรับอิเล็กตรอนและโปรตอน กระบวนการนี้ก่อให้เกิดการสังเคราะห์เอทีพี ก่อให้เกิดผลิตภัณฑ์ทางเทคโนโลยีชีวภาพ เช่น กรดแลกติก หรือ เอทิลแอลกอฮอล์ เป็นต้น 17
คำถามทบทวน
1. อธิบายความหมายและองค์ประกอบของเซลล์มาให้เข้าใจ
2. ดีเอ็นเอและอาร์เอ็นเอมีความเหมือนหรือแตกต่างกันอย่างไร
3. ดีเอ็นเอควบคุมการสร้างโปรตีนได้อย่างไร
4. จงอธิบายโครงสร้างของดีเอ็นเอว่ามีลักษณะอย่างไร
5. จงอธิบายกระบวนการจาลองตัวเองของดีเอ็นเอว่ามีขั้นตอนอย่างไรบ้าง
6. จงอธิบายความหมายของคาว่าเมตาบอลิซึม
7. จงแปรียบเทียบความแตกต่างระหว่างกลุ่มสิ่งมีชีวิตที่สร้างอาหารเองได้กับกลุ่มสิ่งมีชีวิตที่สร้างอาหารเองไม่ได้
8. จงยกตัวอย่างกลุ่มสิ่งมีชีวิตที่สร้างอาหารเองได้กับกลุ่มสิ่งมีชีวิตที่สร้างอาหารเองไม่ได้
9. จงอธิบายขั้นตอนการหายใจระดับเซลล์แบใช้และไม่ใช้ออกซิเจน
10. จงยกตัวอย่างผลิตภัณฑ์ทางเทคเทคโนโลยีชีวภาพที่เกิดจากกระบวนการเมตาบอลิซึม
เอกสารอ้างอิง
Freeman, S. (2005). Biological Science (2 nd ed.). United States of America : Pearson
Prentice Hall.
Hartwell, L.H., Hood, L., Goldberg, M.L., Reynolds, A.E., Silver, L.M. and Veres, R.C. (2000).
Genetics : FROM Genes to Genomes. United States of America: McGraw-Hill.
Hayes, M. F. & Reichsman, F. (2010). DNA and Biotechnology (3rd ed.). United States of
America: Acadermic Press publications.
Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S.L., Matsudaira, P., Baltimore, D and Darnell, J. (2000).
Molecular cell biology (4 th ed.). United States of America : W.H.Freeman.
Mader, S.S. (1994). Introduction to biology. United States of America : Wm. C. Brown
Communication, Inc.
Mix, M.C., Farber, P. & King, K.I. (1996). Biology : The Network of Life (2 nd ed.). United
States of America: Harpercollin College Div.
Renneberg, R. (2006). Biotechnology for Beginners. Germany : Elsevier Inc.
Schmid, R.D. (2003) . Pocket Guide to Biotechnology and Genetic Engineering. Federal
Republic of Germany: WILEY-VCH.
Solomon, E.P., Berg, L.R., Martin, D.W. and Villee, C. (1996). Biology (4 th ed.). United States of
America : Saunder College Publishing.
Wallace, R.A., Sanders, G.P.& Ferl, R.J. (1996). Biology : The science of life (4 th ed.). United
States of America : Harper Collins Publishers Inc.
Weaver, R.F. (2002). Molecular Biology (2 nd ed.). United States of America: McGraw-Hill.
บทที่ 3
พันธุวิศวกรรม
จากความรู้ทางด้านชีววิทยาระดับโมเลกุล ที่มีการพัฒนามาอย่างยาวนานทาให้เข้าใจ เรื่องโครงสร้างและหน้าที่ยีน ทาให้เกิดศาสตร์ที่เรียกว่า พันธุวิศวกรรม การตัดต่อยีน การถ่ายยีนเข้าสู่สิ่งมีชีวิตและการคัดเลือกสิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรม ตามลาดับ
3.1 การจัดเรียงและการแสดงออกของยีน
ยีนเป็นหน่วยพื้นฐานของข้อมูลทางพันธุกรรม ผลของยีนจะสังเกตจากลักษณะภายนอก (phenotype) ยีนที่อยู่บนดีเอ็นเอ (DNA) หรือโครโมโซม (chromosome) จะถูกถอดรหัสไปเป็นโมเลกุลเอ็มอาร์เอ็นเอ (mRNA) และถูกแปลรหัสไปเป็นโปรตีน แต่ยีนสาหรับอาร์อาร์เอ็นเอ (rRNA) และทีอาร์เอ็นเอ (tRNA) จะไม่ถูกแปลรหัส ยีนอยู่บนโครโมโซมและบริเวณที่อยู่บนโครโมโซมบางส่วนเรียกว่าโลกัส (locus) จะเป็นที่อยู่ของยีน ในสิ่งมีชีวิตดิพพลอยด์ (diploid) ตาแหน่งยีนจะอยู่บนโครโมโซมคนละโครโมโซมแต่จะมีตาแหน่งเดียวกันเรียกว่าอัลลี (alleles) (ภาพที่ 3.1)
ภาพที่ 3.1 การแสดงออกของยีน (A) เซลล์โปรคารีโอติก (B) เซลล์ยูคารีโอติก
ที่มา (Brown , 1999, p. 4)
โมเลกุลดีเอ็นเอสายคู่ มีศักยภาพในการเก็บข้อมูลทางพันธุกรรม การตั้งชื่อของดีเอ็นเอสองสาย โดยระบบไอยูบี (IUB , international union of biochemistry) และระบบไอยูแพค (IUPAC, international union of pure and applied chemistry) เช่น สายดีเอ็นอแต่ละสายเรียกว่า เทมเพต (template) และ นอนเทมเพต (non-template) ข้อมูลทางพันธุกรรมจะแสดงออกโดยการถอดรหัสจากสายนอน-โค็ดดิ่ง (non-coding strand) การผลิตเอ็มอาร์เอ็นเอจะมีลาดับเบสเหมือนกับสาย โค็ดดิ่ง (coding strand) ของสายดีเอ็นเอแต่มีเบสยูราซิลแทนเบสไทมีน
ลำดับเบสจาเพาะที่เป็นรหัสสาหรับโปรตีนเรียกว่า โค็ดดิ่งยีน (coding gene) นอกจากนี้ยังมีบริเวณควบคุม (regulatory region) นอกจากนี้ยังมีบริเวณส่งเสริม (promoter region) ซึ่งเป็นบริเวณที่จับของเอนไซม์อาร์เอ็นเอ พอรีเมอเรส (RNA polymerase) และบริเวณเริ่มต้นการถอดรหัส จุดจบของการถอดรหัส ซึ่งทั้งสองส่วนนี้อยู่ในหน่วยการถอดรหัส (transcriptional unit) บริเวณที่ควบคุมยีนจะอยู่เหนือ (upsteam) และใต้ (downstream) ยีน (ภาพที่ 3.2)
ภาพที่ 3.2 การจัดเรียงยีนในเซลล์โปรคารีโอติกและยูคารีโอติก
ที่มา (Reece, 2004, p. 41)
3.1.1 โครงสร้างยีนในโปรคารีโอติก
เซลล์โปรคารีโอติก เช่น เซลล์แบคทีเรีย ยีนจะอยู่เป็นกลุ่มเรียกว่าโอเปอรอน (operon) ตัวอย่างเช่น แลกโอเปอรอน (lac operon) (ภาพที่ 3.3) ซึ่งจะเกี่ยวกับเมตาบอลิซึมของน้าตาลแลกโทส (lactose) โอเปอรอนนี้จะมีสามยีนที่จะถูกเปลี่ยนเป็นเอนไซม์หรือโปรตีน และมีบริเวณเหนือยีนประกอบด้วยโปรโมเตอร์ รีกลูเรเตอร์และโอเปอเรเตอร์ ในบริเวณควบคุม (control region) จะมีบริเวณที่จับกับซีเอเอ็มพี (cAMP) และ ซีอาร์พี (CRP , cyclic AMP receptor protein) ซึ่งมีความสาคัญกับการกระตุ้นทางบวกของการถอดรหัส ส่วนนอกบริเวณโอเปอรอนจะมียีนรีเพรสเซอร์ (repressor gene) จะผลิตโปรตีนรีเพรสเซอร์ (lac repressor) ซึ่งจะจับกับบริเวณโอเปอเรเตอร์ และตอบสนองการควบคุมแบบลบ ซึ่งจะขัดขวางการจับของเอนไซม์อาร์เอ็นเอพอรีเมอเรส
ภาพที่ 3.3 โครงสร้างแลกโอเปอรอนในแบคทีเรีย
ที่มา (Reece, 2004, p. 45)
3.1.2 โครงสร้างของยีนในยูคารีโอติก
เซลล์ยูคารีโอติก เช่น เซลล์พืชและสัตว์ จะมีเยื่อหุ้มนิวเคลียส ดีเอ็นเอจะอยู่ในโครโมโซม การถอดรหัสจะเกิดในนิวเคลียส ส่วนการแปลรหัสจะเกิดในไซโตพลาสซึม ในเซลล์ยูคารีโอติกยังมีสารพันธุกรรมอยู่ในอวัยวะในเซลล์หรือออร์กาเนลล์ (organelle) ที่เรียกว่า ไมโตคอนเดรีย (mitochondria) และคลอโรพลาสต์ (chloroplast) ในปี ค.ศ. 1977 มีการศึกษายีนในเซลล์ยูคารีโอติก ลาดับเบสจะมีส่วนที่เรียกว่า อินทรอน (intron , intervening sequence) และส่วนที่เรียกว่า แอกซอน (exon) ซึ่งจะมีการถอดรหัสและแปลรหัสเป็นโปรตีน การมีอินทรอนมีความสาคัญกับการแสดงออกของข้อมูลพันธุกรรมในเซลล์ยูคารีโอติกโดยอินทรอนจะถูกกาจัดออกก่อนการแปลรหัสของเอ็มอาร์เอ็นเอ มีการเติมหมู่ เจ็ด เมทิล กวาโนซีน (7- methyl guanosine) เข้าที่ปลาย 5’ และ เติมเบสอดีนิน (poly A tail) หลายๆตัวเข้าที่ปลาย 3’ ของสายเอ็มอาร์เอ็นเอ เรียกกระบวนการนี้ว่า การดัดแปลงเอ็มอาร์เอ็นเอ (RNA processing) (ภาพที่ 3.4)
ภาพที่ 3.4 โครงสร้างยีนและการดัดแปลงเอ็มอาร์เอ็นเอในเซลล์ประเภทยูคารีโอติก
ที่มา (Nicholl, 2002, p. 20)
3.1.3 การแสดงออกของยีน
ข้อมูลทางพันธุกรรมจะถ่ายทอดจากดีเอ็นเอไปเป็นโปรตีน โดยผ่านกระบวนการถอดรหัสและแปลรหัส การถอดรหัสจะเกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์อาร์เอ็นเอโดยใช้ดีเอ็นเอเป็นแม่พิมพ์ โดยการทางานของเอนไซม์อาร์เอ็นเอ พอรีเมอเรส การถอดรหัสจะมีสี่ขั้นตอน หนึ่ง เอนไซม์อาร์เอ็นเอ พอรีเมอเรสจับ สองการสร้างสายเริ่ม (chain initiation) สาม สายยืด (chain elongation) และสี่ สิ้นสุดสาย (chain termination) การแปลรหัสต้องการโมเลกุลเอ็มอาร์เอ็นเอรวมกับทีอาร์เอ็นเอ และไรโบโซม ไรโบโซมจะเป็นบริเวณสังเคราะห์โปรตีน โดยเอ็มอาร์เอ็นเอจะมีโคดอน (codon) และจะเหมาะสมกับแอนติโคดอน (anticodon) ของทีอาร์เอ็นเอ โมเลกุลเอ็มอาร์เอ็นเอจะแปลรหัสจาก ปลาย 5’ ไป 3’ เกิดเป็นสายโพลีเปปไทด์จากปลายเอ็นไปสู่ซี (ภาพที่ 3.5)
ภาพที่ 3.5 การแสดงออกของยีน
ที่มา (Wallace et al., 1996, p. 288)
3.2 พันธุวิศวกรรม
พันธุวิศวกรรม (genetic engineering) หมายถึง การตัดต่อยีนจากสิ่งมีชีวิตต่างชนิดกันเพื่อให้เกิดการเปลี่ยนแปลงลักษณะพันธุกรรมที่มนุษย์ต้องการ มีการพัฒนาความรู้ด้านพันธุวิศวกรรม มากกว่า 30 ปี ในห้องปฏิบัติการทดลองทั่วโลก มีการแยกชิ้นดีเอ็นเอจากจีโนม (genome) ของสิ่งมีชีวิต แล้วทาการหาลาดับเบส และทาการหาหน้าที่ พันธุวิศวกรรมสามารถนาไปประยุกต์ใช้ทางการแพทย์ (medical) และอุตสาหกรรมทางเทคโนโลยีชีวภาพ (biotechnology industry)
การพัฒนาความรู้ทางพันธุวิศวกรรม เกิดจากความรู้ทางพันธุศาสตร์(genetics) เริ่มจาก เกอเกอร์ เมนเดล (Gregor Mendel) อีกสี่สิบปีต่อมาก็มีการศึกษาเรื่องราวพันธุกรรมและแผนที่พันธุกรรม ความรู้ที่เป็นฐานที่สาคัญอีกเรื่องหนึ่ง คือ พันธุศาสตร์จุลินทรีย์ (microbial genetics) ในกลางปี ค.ศ. 1940 นอกจากนี้ยังมีการศึกษาเรื่องกลไกการถ่ายยีน(gene transfer) ในแบคทีเรีย (bacteria) การค้นพบโครงสร้างดีเอ็นเอ โดยเจมส์ วัตสันและฟรานซิส คริก (James Watson and Francis Crick) ในปี ค.ศ. 1953 ซึ่งทาให้เข้าใจถึงการแสดงออกของยีน และ ในปี ค.ศ. 1996 ก็มีการค้นพบรหัสพันธุกรรม (genetic code) หลัง ปี ค.ศ. 1960 นักวิทยาศาสตร์ที่ทางานวิจัยและการพัฒนาที่เกี่ยวกับรากฐานของกระบวนการพันธุวิศวกรรม คือในปี ค.ศ. 1967 ได้มีการแยกเอนไซม์ดีเอ็นเอไลเกส (DNA ligase) ทาหน้าทีเชื่อมดีเอ็นเอสองสายเข้าด้วยกันกลายเป็นโมเลกุลรีคอมบิแนนท์ (recombinant molecule) นอกจากนี้ในปี ค.ศ. 1970 ยังมีการแยกเอนไซม์ตัดจำเพาะ (restriction enzyme) ซึ่งทาหน้าที่ในการตัดสายดีเอ็นเอ ในปี ค.ศ. 1972 มีการสร้างโมเลกุลรีคอมบิแนนท์จากต่างสิ่งมีชีวิต ขึ้นเป็นครั้งแรกที่มหาวิทยาลัยสแตนฟอร์ด (Stanford University) ในปี ค.ศ. 1973 มีการนาชิ้นดีเอ็นเอเข้าสู่พลาสมิด pSC101 (เป็นโครโมโซมภายนอก (extrachromosomal element) ที่แยกจาก แบคทีเรีย Escherichia coli) โมเลกุลรีคอมบิแนนท์ จะมีเรพลิคอน (replicon) สามารถจาลองตัวเองได้เมื่อเข้าสู่แบคทีเรีย Escherichia coli ดังนั้นการสร้างโมเลกุลดีเอ็นเอลูกผสมหรือรีคอมบิแนนท์ จะสร้างในหลอดทดลอง (in vitro) และการจาลองตัวเองในแบคทีเรีย (in vivo) ชิ้นส่วนจาเพาะของดีเอ็นเอ สามารถแยกจากโคโลนี ของแบคทีเรีย (colonies bacteria) ที่โคลน (clone , โคโลนีจากเซลล์เดียว) ที่โตบนจานอาหารวุ้น (agar plate) เทคโนโลยีนี้อาจเรียกว่า ยีนโคลนนิ่ง (gene cloning) (ภาพที่ 3.6)
ภาพที่ 3.6 พันธุวิศวกรรมแบคทีเรีย
ที่มา (Brown, 2010, p. 5) 7
3.3 การตัดต่อยีน
กระบวนการพันธุวิศวกรรมจาเป็นจะต้องตัดและต่อดีเอ็นเอหรือตัดต่อยีน จากแหล่งต่างๆ กัน รวมถึงการดัดแปลงก็จะทาให้เกิดเป็นดีเอ็นเอลูกผสม (recombinant DNA) เครื่องมือที่ใช้ในการจัดการยีน คือ เอนไซม์ (enzyme) ซึ่งสามารถแยกจากสิ่งมีชีวิตต่างๆและหาซื้อได้จากตัวแทนจาหน่าย
3.3.1 เอนไซม์ตัดจำเพาะ
เอนไซม์ตัดจำเพาะ (restriction enzyme) จะตัดดีเอ็นเอที่บริเวณจาเพาะ เป็นเอนไซม์กลุ่มหนึ่งที่มีความสาคัญต่อการจัดการดีเอ็นเอ เอนไซม์กลุ่มนี้ค้นพบในแบคทีเรีย มีหน้าที่ในการป้องกันตัวเองที่เรียกว่า ระบบเรสติกชัน –ม็อดดิฟิเคชัน (restriction – modification system) ในระบบนี้เอนไซม์ตัดจาเพาะจะไฮโดรไลซ์ (hydrolyses) ดีเอ็นเอภายนอกที่ปรากฏในเซลล์ การป้องกันกิจกรรมของเอนไซม์ที่จะย่อยดีเอ็นเอของตัวเองคือ ดีเอ็นเอของเซลล์เจ้าบ้านจะมีการใช้เอนไซม์ดัดแปลงของระบบที่เรียกว่า เอนไซม์เมทิลเลส (methylase) ดัดแปลงดีเอ็นของเซลล์เจ้าบ้านโดยกระบวนการเมทิเลชัน (methylation) ทาให้ป้องกันการตัดจากเอนไซม์ตัดจาเพาะ เอนไซม์ตัดจาเพาะมีสามชนิด ได้แก่ ชนิดที่หนึ่ง (I) ชนิดที่สอง (II) และชนิดที่สาม (III) เอนไซม์ตัดจาเพาะที่ใช้ในงานพันธุวิศวกรรม คือ เอนไซม์ตัดจาเพาะชนิดที่สอง เป็นเอนไซม์ในกลุ่มที่เรียกว่านิวคลีเอส (nuclease) และสามารถตัดภายในดีเอ็นเอรู้จักกันในนาม เอนโดนิวคลีเอส (endonuclease)
เอนไซม์ตัดจำเพาะหรือเอนโดนิวคลีเอส ชนิดที่สอง (Type II restriction endonuclease) เอนไซม์ตัดจาเพาะจะมีระบบเรียกชื่อ (nomenclature) บนฐานของจานวนแบบเก่า โดยใช้ชื่อจีนัสและชื่อสปีชีล์ ของสิ่งมีชีวิตที่ค้นพบเอนไซม์นั้น โดยตัวอักษรตัวแรกเป็นจีนัสและตามด้วยอักษร หนึ่งถึงสองตัวเป็นชื่อสปีชีล์ เช่น เอนไซม์ตัดจาเพาะจากสายพันธุ์ Escherichia coli อยู่ในเทอม Eco ถ้ามาจาก Bacillus amyloliquefaciens จะเขียนด้วย Bam มีเอนไซม์ตัดจาเพาะ BamHI กับบริเวณจดจา (recognition sequence)ได้
เอนไซม์ตัดจำเพาะมีความจาเพาะเจาะจงที่บริเวณจดจาของลาดับเบสในดีเอ็นเอ ส่วนใหญ่ บริเวณจดจาปกติ จะมี สี่ ห้า หรือหก คู่เบส ถ้ามีบริเวณจดจาสี่เบสในดีเอ็นเอและมีการตัดแบบสุ่มบนเบสที่กระจายตัวแบบสุ่ม ความถี่ของการตัดสามารถจะคานวณได้โดยใช้สูตร 4n โดย n คือ ความยาวของเบสบริเวณจดจา จะมีจุดตัดเกิดขึ้นทุกๆ 256 คู่เบส ถ้าบริเวณจดจามีห้านิวคลีโอไทด์หรือห้าคู่เบส จะมีจุดตัดเกิดขึ้นทุก ๆ 1024 คู่เบส ถ้าบริเวณจดจามีหกนิวคลีโอไทด์หรือหกคู่เบส จะมีจุดตัดเกิดขึ้นทุกๆ 4096 คู่เบส เอนไซม์ตัดจาเพาะที่มีบริเวณจดจาเป็นสี่นิวคลีโอไทด์ อาจเรียกอีกชื่อว่า โฟ คัดเทอร์ (four – cutter) พร้อมทั้งบอกบริเวณจดจาและการเกิดปลายหลังจากการตัด (cutting sites) ชนิดของชิ้นดีเอ็นเอจะเกี่ยวกับบริเวณจดจาของเอนไซม์ตัดจาเพาะ ซึ่งจะมีการเกิดปลายดีเอ็นเอได้สามแบบ โดยแบบที่หนึ่ง ปลายทู่ (blunt or flush – end fragment) แบบที่สอง ปลายเหนียวหรือปลายยื่นด้าน 3’ (protruding 3’ end) และแบบที่สามปลายเหนียวหรือปลายยื่นด้าน 5’ (protruding 5’ end) (ภาพที่ 3.7)
ภาพที่ 3.7 ปลายดีเอ็นเอที่เกิดจากการตัดด้วยเอนไซม์ตัดจาเพาะ ชนิดที่สอง
ที่มา (Nicholl, 2002, p. 46)
เอนไซม์ตัดจาเพาะ เช่น Pst I และ EcoR I ที่ให้กาเนิดชิ้นดีเอ็นเอ ปลายเหนียว (cohesive or sticky end) ที่สามารถจับคู่เบสที่คู่สม (complementary sequence) ที่เกิดจากเอนไซม์ชนิดเดียวกัน ดังนั้นการตัดดีเอ็นเอตัวอย่างสองชนิด กับเอนไซม์ตัดจาเพาะตัวเดียวกันแล้วผสมกันก่อให้เกิดลูกผสม (ภาพที่ 3.8) เป็นการใช้ประโยชน์ของเอนไซม์ในการจัดการยีนของกระบวนการทาพันธุวิศวกรรม
ภาพที่ 3.8 ดีเอ็นเอลูกผสม
ที่มา (Wallace et al., 1996, p. 320)
3.3.2 เอนไซม์ที่ใช้ดัดแปลงดีเอ็นเอ
เอนไซม์ตัดจาเพาะและดีเอ็นเอไลเกส (DNA ligase) ใช้ในการตัดและต่อซึ่งจะจาเป็นในการผลิตดีเอ็นเอสายผสม นอกจากนี้ยังมีเอนไซม์ที่ใช้ดัดแปลงดีเอ็นเอ เกี่ยวข้องกับการย่อย (degradation) การสังเคราะห์ (synthesis) และการแลกเปลี่ยนดีเอ็นเอ (alteration)
1) เอนไซม์นิวคลีเอส (nuclease) ย่อยสลายกรดนิวคลีอิกโดยการทาลายพันธะฟอสฟอไดเอสเทอร์ บอนด์ (phosphodiester bond) เอนไซม์ตัดจาเพาะเป็นตัวอย่างที่ดีของเอนโดนิวคลีเอส (endonuclease) ที่ใช้ในการตัดสายดีเอ็นเอ กลุ่มที่สองของนิวคลีเอสจะย่อยสลายดีเอ็นเอจากปลายของโมเลกุลดีเอ็นเอเรียกว่า เอกซ์โซนิวคลีเอส (exonuclease) เอนไซม์นิวคลีเอส มีสี่ชนิดที่ใช้ในพันธุวิศวกรรม Bal 31 และ เอกซ์โซนิวคลีเอส 3 (exonuclease III,exonuclease) และ เอนไซม์ดีออกซีไรโบนิวคลีเอส หนึ่ง (deoxyribonuclease I , Dnase I) และเอนไซม์ เอส วัน นิวคลีเอส (S1 – nuclease (endonuclease)) เอนไซม์กลุ่มนี้มีความหลากหลายในการทางาน นอกจากนี้ยังมีเอนไซม์ไรโบนิวคลีเอส (ribonuclease) ซึ่งจะมีผลต่ออาร์เอ็นเอ (ภาพที่ 3.9)
ภาพที่ 3.9 กลุ่มเอนไซม์นิวคลีเอส
ที่มา (Brown, 2010, p. 47 – 48)
2) เอนไซม์พอลีเมอเรส (polymerase) ใช้ในการสังเคราะห์โมเลกุลกรดนิวคลีอิก และใช้ในกระบวนการพันธุวิศวกรรม เอนไซม์พอลีเมอเรส อยู่ในเทอม DNA-dependent หรือ RNA-dependent ซึ่งจะบ่งชี้ถึงกรดนิวคลีอิกที่ใช้เป็นแม่พิมพ์ ดังนั้น เอนไซม์ DNA – dependent DNA polymerase จะสร้าง ดีเอ็นเอโดยใช้ดีเอ็นเอเป็นแม่พิมพ์ ส่วนเอนไซม์ RNA – dependent DNA polymerase จะสร้าง ดีเอ็นเอโดยใช้อาร์เอ็นเอเป็นแม่พิมพ์ และเอนไซม์ DNA – dependent RNA polymerase จะสร้าง อาร์เอ็นเอโดยใช้ดีเอ็นเอเป็นแม่พิมพ์ ทิศทางการสังเคราะห์สารพันธุกรรมสายใหม่ จาก 5 ไป 3 โดยการเกิดพันธะฟอสฟอไดเอสเทอร์ บอนด์ขึ้นที่ปลาย 3 OH เอนไซม์ดีเอ็นเอพอลีเมอเรส วัน (DNA polymerase I) มีคุณสมบัติพอลีเมอเรส จากปลายห้าไปสาม และ การย่อยสลายสายดีเอ็นเอจากปลายสามไปห้า (3,5 exonuclease) และย่อยสลายสายดีเอ็นเอจากปลายห้าไปสาม (5,3 exonuclease) ซึ่งจะย่อยสลายสายที่ไม่ใช่แม่พิมพ์ นอกจากนี้ยังเกี่ยวกับปฏิกิริยา นิก ทรานสเลชัน ที่ใช้ในการติดฉลากดีเอ็นเอ เอนไซม์ดีเอ็นเอ พอลีเมอเรส วันที่ไม่มีกิจกรรมการย่อยสลายสายดีเอ็นเอจากปลายห้าไปสาม เรียกว่า คลีนาว แฟกเมนต์ (Klenow fragment) ซึ่งยังมีคุณสมบัติการพอลีเมอเรสและย่อยสลายสายดีเอ็นเอจากปลายสามไปห้า เอนไซม์คลีนาว แฟกเมนต์ ใช้ในการสร้างดีเอ็นเอสายใหม่โดยใช้ดีเอ็นเอสายเดี่ยวเป็นแม่พิมพ์ เพราะว่าคุณสมบัติ การย่อยสลายสายดีเอ็นเอจากปลายห้าไปสาม ขาดหายไป เอนไซม์นี้ไม่สามารถย่อยสายที่ไม่ใช่แม่พิมพ์ของสายคู่ระหว่างการสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่ จุดหลักในการใช้เอนไซม์คลีนาว แฟกเมนต์ เกี่ยวข้องกับการติดฉลากกัมมันตภาพรังสีและการหาลาดับเบส เอนไซม์อีกตัวหนึ่งที่อยู่ในกลุ่มนี้และมีความสาคัญมากคือ เอนไซม์รีเวอรส์ ทรานสเครปเทส (reverse transcriptase) เป็นเอนไซม์ RNA – dependent DNA polymerase จะสร้าง ดีเอ็นเอโดยใช้อาร์เอ็นเอเป็นแม่พิมพ์ ไม่มีคุณสมบัติเอกซ์โซนิวคลีเอส (exonuclease activity) เอนไซม์ตัวนี้ใช้ประโยชน์ในการใช้ mRNA เป็นแม่พิมพ์เพื่อสร้างเป็น ซีดีเอ็นเอ (cDNA , complementary DNA) (ภาพที่ 3.10)
ภาพที่ 3.10 กลุ่มเอนไซม์พอลีเมอเรส
ที่มา (Brown, 2010, p. 49)
3.3.3 เอนไซม์ที่ใช้ในการดัดแปลงปลายโมเลกุลดีเอ็นเอ
ได้แก่ เอนไซม์อัลคาไลน์ ฟอสฟาเทส (alkaline phosphatase) เอนไซม์โพลีนิวคลีโอไทด์ ไคเนส (polynucleotide kinase) และเอนไซม์เทอมินอล ทรานสเฟอเรส (terminal transferase) เอนไซม์ฟอสฟาเทสและไคเนสจะมีความเกี่ยวข้องกับการกาจัดและการเติม กลุ่มฟอสเฟต เอนไซม์แบคทีเรีย อัลคาไล ฟอสฟาเทส (BAP : Bacteria alkaline phosphatase ซึ่งจะใกล้เคียงกับ Calf intestinal alkaline phosphatase , CIP) จะกาจัดหมู่ฟอสเฟตจากปลายห้าของดีเอ็นเอ และทาให้ ปลายห้า เป็นหมู่ OH เอนไซม์นี้ใช้ในการป้องการไลเกชัน (ligation) กันเองของโมเลกุลดีเอ็นเอ เอนไซม์อีกตัวหนึ่งคือเอนไซม์โพลีนิวคลีโอไทด์ ไคเนส ใช้ในการเติมสารกัมมันตภาพรังสีฟอสเฟตเข้าที่ปลายห้าของสายดีเอ็นเอ
เอนไซม์เทอมินอล ทรานสเฟอเรส ( terminal transferase / terminal deoxynucleotidyl transferase) จะทาการเติมนิวคลีโอไทด์เข้าที่ปลายสาม เอนไซม์นี้สามารถเติมหางแบบโฮโมโพลีเมอร์ เทลลิ่ง (homopolymer tailing) (ภาพที่ 3.11)
ภาพที่ 3.11 กลุ่มเอนไซม์ดัดแปลงปลายดีเอ็นเอ
ที่มา (Brown, 2010, p. 50)
3.3.4 ดีเอ็นเอ ไลเกส
เอนไซม์ดีเอ็นเอ ไลเกส (DNA ligase) เป็นเอนไซม์ในเซลล์ มีหน้าที่ในการซ่อมพันธะ ฟอสฟอไดเอสเทอร์บอนด์ ระหว่างดีเอ็นเอริพพลิเคชัน เอนไซม์ที่ใช้ในการทดลอง ได้แก่ ทีสี่ ดีเอ็นเอ ไลเกส (T4 DNA ligase) ซึ่งแยกจาก E. coli ที่ติดเชื้อ แบคเทอริโอฟาจ ที่สี่ (T4) เอนไซม์นี้สามารถเชื่อมทั้งปลายเหนียวและปลายทู่ ภายใต้ภาวะเหมาะสม เอนไซม์นี้จะทางานได้ดีที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส แต่อาจจะใช้อุณหภูมิต่า (14-15 องศาเซลเซียส) ในการป้องกันการเสียสภาพของบริเวณคู่เบสที่สั้น ที่เป็นปลายเหนียว (ภาพที่ 3.12)
ภาพที่ 3.12 เอนไซม์ดีเอ็นเอไลเกส
ที่มา (Brown, 2010, p. 48)
3.4 การถ่ายยีนเข้าสู่สิ่งมีชีวิต
โมเลกุลดีเอ็นเอลูกผสมจะถูกสร้างในหลอดทดลอง โดยใช้เวกเตอร์ (vector) เป็นโมเลกุลพาหะ และนาเข้าสู่สิ่งมีชีวิตหรือเซลล์เจ้าบ้าน (host cell) ในหัวข้อนี้จะกล่าวถึงชนิดของเซลล์เจ้าบ้านและระบบเวกเตอร์และการถ่ายยีนเข้าสู่เซลล์หรือสิ่งมีชีวิต
3.4.1 ชนิดของเซลล์เจ้าบ้าน
ชนิดของเซลล์เจ้าบ้านใช้สาหรับการประยุกต์ขึ้นกับวัตถุประสงค์ของการทาการทดลองโคลนนิ่ง ถ้าจุดประสงค์เพื่อแยกยีนและการวิเคราะห์โครงสร้าง ต้องการระบบง่ายๆ แต่ถ้าเป็นจุดประสงค์เพื่อการแสดงออกของสารพันธุกรรม ระบบที่ซับซ้อนกว่า (ตารางที่ 3.1)
ตารางที่ 3.1 ตัวอย่างเซลล์เจ้าบ้าน
ที่มา (Nicholl, 2002, p. 58) 13
1) เซลล์เจ้าบ้านชนิดโปรคารีโอติก ความคิดเกี่ยวกับเซลล์เจ้าบ้านก็คือง่ายต่อการจัดการและขยายพันธุ์รวดเร็ว เป็นสายพันธุ์ที่มีการศึกษาพันธุกรรมของสายพันธุ์อย่างชัดเจน และใช้ได้กับหลากหลายเวกเตอร์ แบคทีเรียชื่อว่า Escherichia coli ใช้ในวิธีการโคลน E. coli ได้ถูกศึกษารายละเอียดทางพันธุ-ศาสตร์ทางจุลินทรีย์ และเป็นฐานที่สาคัญทางพันธุวิศวกรรม แบคทีเรีย E. coli เป็นแบคทีเรียแกรมลบ และมีโครโมโซมเดียว (single chromosome) ที่เรียกว่า นิวคลีออยด์ (nucleoid) มีขนาดจีโนม 4.6 x 106 คู่เบส และรู้รายละเอียดลาดับเบสทั้งหมดแล้ว กระบวนการแสดงออก (ถอดรหัสและแปลรหัส) เกิดขึ้นพร้อมกัน ไม่มีกระบวนการโพส ทรานสเครปชัน ม็อดดิฟิเคชัน (post-transcription modification ) แบคทีเรีย E. coli เป็นเซลล์เจ้าบ้านที่ง่ายและใช้เป็นประจาในห้องปฏิบัติการ นอกจากมีการใช้ แบคทีเรีย E. coli สาหรับการทายีน โคลนนิ่ง แล้วยังมีเซลล์เจ้าบ้านที่เป็นแบคทีเรีย Bacillus , Pseudomonas และ Streptomyces แต่จุดเริ่มต้นมักจะทาการโคลนยีนใน แบคทีเรีย E. coli ก่อนแล้วค่อยแยกลาดับเบสที่ต้องการให้บริสุทธ์ แล้วนาไปใส่ในเซลล์เจ้าบ้านเป้าหมาย เพราะฉะนั้นต้องใช้ดีเอ็นเอหรือเวกเตอร์ที่ทางานได้ทั้งในเซลล์เจ้าบ้านเป้าหมายและแบคทีเรีย E. coli เรียกเวกเตอร์ชนิดนี้ว่า ชัทเตอร์ เวกเตอร์ (shuttle vector)
2) เซลล์เจ้าบ้านยูคารีโอติก เช่น ยีสต์ (yeast) และสาหร่าย (algae) หรือเซลล์ที่มาจากสิ่งมีชีวิตที่มีหลายเซลล์และมีความซับซ้อน เซลล์จุลินทรีย์มีลักษณะที่เด่นในแบคทีเรียและนามาใช้ในกระบวนการพันธุวิศวกรรม คือเจริญเติบโตง่ายและรวดเร็ว พร้อมกันนั้นยังมีการกลายพันธุ์ เซลล์ยูคารีโอติกชั้นสูงมีปัญหาที่แตกต่างและต้องการการแก้ปัญหาที่พิเศษ จุดประสงค์ของการทดลองทางพันธุวิศวกรรมในพืชชั้นสูงและสัตว์ ทาให้มีพันธุกรรมเปลี่ยนแปลงไป โดยเรียกว่า ทรานสเจนนิก (transgenic) ยีสต์ชนิดที่เรียกว่า Saccharomyces cerevisiae เป็นหนึ่งในยูคารีโอตที่ใช้ในพันธุวิศวกรรม ในศตวรรษที่แล้วยังใช้ในการผลิตขนมปังและเบียร์ ยีสต์เป็นสิ่งมีชีวิตที่ใช้ในการวิเคราะห์พันธุกรรมแบบเก่าและมีการกลายพันธุ์ ยีสต์ Saccharomyces cerevisiae มีจีโนมซับซ้อนกว่า E. coli 3.5 เท่า นอกจากนี้ยังมีฟังก์ใจชนิดอื่นๆที่มีการศึกษาจีโนมและใช้ในการทดลองพันธุวิศวกรรม เช่น Aspergillus nidulans และ Neurospora crassa เซลล์พืชและสัตว์ใช้เป็นเซลล์เจ้าบ้านสาหรับการทดลองจัดการยีน เซลล์เดียวเช่น สาหร่าย Chlamydomonas reinbardtii มีโครงสร้างและหน้าที่ของเซลล์พืช เซลล์พืชและเซลล์สัตว์จะสามารถโตได้โดยการเพาะเลี้ยงเซลล์ (ภาพที่ 3.13)
ภาพที่ 3.13 ตัวอย่างเซลล์เจ้าบ้าน
ที่มา (Clark & Pazdernik , 2009, pp. 20 – 22)
3.4.2 เวกเตอร์หรือดีเอ็นเอพาหะ
เวกเตอร์ (vector) หรือดีเอ็นเอพาหะมีหน้าที่สาคัญในการพาดีเอ็นเอหรือยีนเป้าหมายเข้าสู่เซลล์เจ้าบ้าน การที่จะเลือกใช้เวกเตอร์ประเภทใดก็จะขึ้นกับขนาดของชิ้นยีนและชนิดของเซลล์เจ้าบ้าน
1) เวกเตอร์สาหรับเซลล์โปรคารีโอติก) คือ พลาสมิด (plasmid) พลาสมิดเป็นโมเลกุลดีเอ็นเอขนาดเล็ก ง่ายต่อการแยกและจัดการและที่สาคัญต้องมีจุดจาลองตัวเอง (origin of replication) คือ สามารถก็อปปี้และยังคงอยู่ในประชากรของเซลล์และเจริญในเซลล์เจ้าบ้านและแบ่งตัวได้ พลาสมิดยังมีส่วนที่สาคัญอีกส่วนหนึ่งคือยีนเครื่องหมาย (selectable marker) ใช้ในการตรวจสอบเวกเตอร์ เวกเตอร์จะต้องมีบริเวณจดจาของเอนไซม์ตัดจาเพาะอย่างน้อยหนึ่งชนิดที่จะทาให้ดีเอ็นเออื่นๆแทรกเข้าไปเพื่อผลิตเป็นรีคอมบิแนนท์ พลาสมิดเป็นสิ่งที่พบในธรรมชาติ เช่น ในแบคทีเรียและยีสต์บางชนิด มีลักษณะเป็นโมเลกุลดีเอ็นเอวงกลม (circular DNA molecule) ขนาดเล็กเมื่อเปรียบเทียบกับโครโมโซม พลาสมิดจะอยู่นอกโครโมโซม (extrachromosome) พลาสมิดปกติจะไม่มีความจาเป็นต่อการเจริญและการแบ่งเซลล์ แต่มีคุณสมบัติในการต้านยาปฏิชีวนะ (antibiotic resistance) ในเซลล์เจ้าบ้าน ยีนต้านยาปฏิชีวนะ (antibiotic resistance gene) จะอยู่บนพลาสมิด (pDNA , plasmid DNA) ใช้เป็นเวกเตอร์ในกระบวนการพันธุวิศวกรรมและสะดวกในการคัดเลือกเซลล์ที่ได้รับพลาสมิด พลาสมิดสามารถจะแบ่งได้สองชนิด ได้แก่ คอนจูเกตีฟ (conjugative) และนอน-คอนจูเกตีฟ (non-conjugative) พลาสมิดคอนจูเกท สามารถถ่ายเทระหว่างแบคทีเรียโดยกระบวนการคอนจูเกชัน โดยการต้องการหน้าที่ โดยบริเวณ ทราน (tra , transfer)และ ม็อบ (mob , mobilising) บนพลาสมิด สาหรับนอน-คอนจูเกตีฟพลาสมิด จะไม่การจัดจาแนกเป็นฐานจานวนก็อปปี้ของพลาสมิดที่พบในเซลล์เจ้าบ้าน จะรู้จักในนามจานวนก็อปปี้ พลาสมิดจานวนก็อปปี้จานวนต่า แสดงออกแบบสตริงเจน (stringent control) ของการจาลองตัวเอง การจาลองของพลาสมิด pDNA ปิด พลาสมิดที่มีจานวนก็อปปี้จานวนมาก จะอยู่ในรูปของ รีแลกซ์ พลาสมิด (relaxed plasmid) กับการจาลองตัวเองของดีเอ็นเอจะไม่ขึ้น กับโครโมโซมของเซลล์เจ้าบ้านที่จาลองตัวเอง พลาสมิดคอนจูเกตีฟมีขนาดใหญ่และจาลองตัวเองแบบสตริงเจน และมีจานวนก็อปปี้จานวนต่า ในขณะที่พลาสมิดนอน-คอนจูเกตีฟมีขนาดเล็กและจาลองตัวเองแบบรีแลกซ์ซึ่งมีจานวนก็อปปี้สูง สาหรับกระบวนการพันธุวิศวกรรม พลาสมิดที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติได้ถูกดัดแปลงเพื่อผลิตเป็นเวกเตอร์ ในนาม p และตามด้วยนามคนที่แยกและประดิษฐพลาสมิด และตามด้วยจานวนที่ใช้ในการจัดจาแนก ความสาคัญของพลาสมิดในประวัติศาสตร์ที่ใช้ในการจัดการยีน คือ pBR322 ซึ่งถูกพัฒนาโดย ฟรานซิสโก โบลิวา (Francisco Bolivar) และคณะ การสร้าง pBR322 จะเกี่ยวข้องกับมวลโมเลกุลต่า ยีนต้านยาปฏิชีวนะ มีจุดจาลองตัวเองและมีบริเวณจุดตัดของเอนไซม์ตัดจาเพาะ (ภาพที่ 3.14)
ภาพที่ 3.14 พลาสมิด pBR322
ที่มา (Campbell & Farrell, 2003, p. 367)
การมียีนต้านยาปฏิชีวนะสองชนิด (AprและTcr) สามารถใช้ในการคัดเลือกเซลล์ที่มีพลาสมิด ก็คือ เซลล์ที่สามารถต้านทานยาปฏิชีวนะแอมพิซิลลิน (ampicillin) และยาปฏิชีวนะเททราไซคลิน (tetracycline) ข้อดีคือมีบริเวณของเอนไซม์ตัดจาเพาะแบบเดียวในบริเวณยีนต้านยาปฏิชีวนะ เพื่อใช้ประโยชน์ในการโคลนดีเอ็นเอ ที่เรียกว่า อินเซอชัน อินแอกทิเวชัน (insertional inactivation) เมื่อใส่ดีเอ็นเอเข้าไปขัดขวางบริเวณรหัสพันธุกรรมยีนต้านยาและจะเป็นการใช้ลักษณะภายนอก (phenotype) ในการคัดเลือกเซลล์ที่มียีนรีคอมบิแนนท์ แม้ว่าพลาสมิด pAT153 และ pBR322 ยังคงถูกใช้ประโยชน์ในการโคลนยีน ในเวกเตอร์แบบง่ายๆจะมีบริเวณเอนไซม์ตัดจาเพาะที่ใช้ในการโคลนดีเอ็นเอ พลาสมิดอาจมีการบรรจุโปรโมเตอร์ที่จาเพาะสาหรับการแสดงออกของชิ้นยีนที่ใส่เข้าไป หนึ่งในพลาสมิดเวกเตอร์ที่ใช้กันอย่างแพร่หลายคือ pUC ซึ่งเป็นพลาสมิดที่มีบริเวณที่บรรจุจุดตัดของเอนไซม์ตัดจาเพาะ ที่เรียกว่า โพลีลิงเกอร์หรือมัลติเปิล โคลนนิงไซด์ (polylinker or multiple cloning site, MCS) และใช้ประโยชน์ ในการใส่ชิ้นดีเอ็นเอลงไปในเวกเตอร์ แผนที่ของเวกเตอร์ pUC (ภาพที่ 3.15)
ภาพที่ 3.15 พลาสมิด pUC
ที่มา (Click & Pasternak, 1998, p. 57)
ในบริเวณที่เป็นโพลีลิงเกอร์หรือเอ็มซีเอส จะเป็นบริเวณของยีน บีต้ากาแลกโตซิเดส (β-galactosidase gene) ทีจะอ่านรหัสเป็น อัลฟา-เปปไทด์ (α-peptide) และถ้าใส่ชิ้นดีเอ็นเอเข้าไปบริเวณนี้จะทาให้ไม่มีการทางานของอัลฟา-เปปไทด์ ทาให้สามารถคัดเลือกรีคอมบิแนนท์จากการดูลักษณะฟ้า – ขาวของโคโลนี ที่เกิดขึ้นเมือเจริญในอาหารที่มี x – gal ในปัจจุบันมีพลาสมิดในรูป โคลนนิง คิท (cloning kit) มีมากมายให้เลือกใช้ แม้ว่าพลาสมิดเวกเตอร์มีการใช้ประโยชน์ในกระบวนการพันธุวิศวกรรม แต่มีข้อจากัดอยู่อย่างหนึ่งว่า ขนาดชิ้นดีเอ็นเอที่ใส่เข้าไปในพลาสมิดมีขนาดใหญ่สุดไม่เกิน 5 กิโลเบส ซึ่งจะมีปัญหากับระบบการทาห้องสมุดจีโนมิก (genomic library) จึงมีการพัฒนาเวกเตอร์ที่ได้มาจากแบคเทอริโอฟาจ แลมป์ดา (bacteriophage lambda (λ)) เอ็ม 13 (M 13) คอสมิด (cosmid) หรือโครโมโซมเทียม เป็นต้น (ภาพที่ 3.16)
ภาพที่ 3.16 ดีเอ็นเอพาหะประเภทอื่นๆ
ที่มา (Clark & Pazdernik , 2009, pp. 57)
พลาสมิดเวกเตอร์จาพวกที่กล่าวมาแล้ว เช่น pBR322 ส่วนใหญ่เป็นเวกเตอร์ที่ใช้เพิ่มจานวนชิ้นดีเอ็นเอหรือยีนเรียกว่า โคลนนิ่ง เวกเตอร์ (cloning vector) แต่ถ้าต้องการให้มีการผลิตโปรตีนหรือเอนไซม์จากชิ้นยีนที่อยู่ในพลาสมิดเวกเตอร์จะต้องเลือกใช้พลาสมิดเวกเตอร์ที่มีองค์ประกอบของบริเวณโปรโมเตอร์ เพื่อกระตุ้นการผลิตโปรตีน เรียกพลาสมิดในกลุ่มนี้ว่า เอกซ์เพรสชัน เวกเตอร์(expression vector) (ภาพที่ 3.17)
ภาพที่ 3.17 พลาสมิด pET-11
ที่มา (Campbell & Farrell, 2003, p. 375)
2) เวกเตอร์สาหรับเซลล์ยูคารีโอติก เมื่อเซลล์เจ้าบ้านเป็นยูคารีโอติก เวกเตอร์ต้องมีความซับซ้อนเซลล์ยูคารีโอตมีโครโมโซมหลากหลายและมีเยื่อหุ้มนิวเคียส ล้อมรอบ ความหลากหลายของเวกเตอร์สาหรับเซลล์ยีสต์ (yeast cell) ได้ถูกพัฒนาและการเลือกเวกเตอร์ขึ้นกับการประยุกต์ใช้ เช่น พลาสมิดยีสต์อิพิโซมอล (Yeast episomal plasmids, Yeps) ก็มีรากฐานจากพลาสมิดทูไมครอน (2 μm plasmid) ในธรรมชาติ และพลาสมิดยีสต์อิพิโซมอลนี้สามารถที่จะจาลองตัวเองอย่างอัตโนมัติ (replicate autonomously)หรือรวม (integrate) เข้าสู่โครโมโซม ความคิดเกี่ยวกับยูคารีโอติกชั้นสูงซึ่งมีหลายเซลล์ (multicellular) เช่น พืช (plant) และสัตว์ (animal) ปัญหาการเหนี่ยวนาดีเอ็นเอลูกผสมเข้าสู่สิ่งมีชีวิตจะมีความแตกต่างจากยูคารีโอติกอื่นๆ ที่เป็นจุลินทรีย์ เช่นยีสต์ จุดประสงค์ของการทาพันธุวิศวกรรมในยูคารีโอตมี สองประการ ประการที่หนึ่งเหนี่ยวนารีคอมบิแนนท์ดีเอ็นเอเข้าสู่เซลล์พืชและสัตว์เพาะเลี้ยง เพื่อศึกษาการแสดงออกของยีนหรือการผลิตโปรตีน ประการที่สองทาการปรับปรุงพันธุกรรมสิ่งมีชีวิตและผลิตสิ่งมีชีวิตแปลงพันธุ์ (transgenic) เวกเตอร์ที่จะใช้ในเซลล์พืชและสัตว์ที่จะเหนี่ยวนาเข้าสู่เซลล์โดยตรงจะใช้กลไกทางชีววิทยาซึ่งได้แก่การใช้ไวรัส (virus) หรือ อะโกรแบคทีเรียม (agrobacterium) (ตารางที่ 3.2)
ตารางที่ 3.2 เวกเตอร์สาหรับเซลล์ยูคารีโอติก
ที่มา (Nicholl, 2002, p. 78)
3.4.3 การนำดีเอ็นเอเข้าสู่เซลล์
การจัดการเวกเตอร์และชิ้นดีเอ็นเอที่ใส่ (insert DNA) จะผลิตโมเลกุลลูกผสม ซึ่งจะเกิดในหลอดทดลองและนาดีเอ็นเอลูกผสมเข้าสู่เซลล์เจ้าบ้าน ประสิทธิภาพของขั้นตอนนี้จะเป็นปัจจัยวิกฤตในการวัดความสาเร็จของการทดลองการโคลน ซึ่งต้องการจานวนรีคอมบิแนนท์จานวนมาก วิธีการนาดีเอ็นเอเข้าสู่เซลล์ขึ้นกับชนิดของเซลล์เจ้าบ้าน /ระบบเวกเตอร์
1) ทรานสฟอร์เมชันและการทรานสแฟกชัน (transformation and transfection) เป็นวิธีการที่ง่าย
สำหรับการนาริคอมบิแนนท์ดีเอ็นเอเข้าสู่เซลล์ ในการโคลนของ E. coli การทรานสฟอร์เมชันหมายถึงการนาพลาสมิดดีเอ็นเอเข้าเซลล์ และการทรานสแฟกชันคือการนาฟาจดีเอ็นเอเข้าเซลล์ การทรานสฟอร์เมชันโดยทั่วๆไปหมายถึงการนาดีเอ็นเอใดๆ เข้าสู่เซลล์ใดๆ ก็ได้ การทรานสฟอร์เมชันในแบคทีเรียค้นพบครั้งแรก ในปีค.ศ. 1928 โดยเฟรดเดอริก กริฟฟิท (Frederick Griffith)ได้ค้นพบ หลักการทรานสฟอร์มิ่ง (transforming principle) โดยการทดลองดังนั้นจึงเป็นทางที่แสดงว่ายีนอยู่ในดีเอ็นเอต่อมาในปี ค.ศ. 1970 มีการสาธิตการทรานสฟอร์เมชันใน E. coli ซึ่งเป็นหลักของเทคโนโลยีการจัดการยีน(gene manipulation technology)หรือพันธุวิศวกรรม การทรานสฟอร์เมชันใน E. coli เซลล์จะต้องทาเป็นเซลล์คอมพลีเทน (completent) โดยการแช่เซลล์ในสารละลายคัลเซียมคลอไรด์ (calcium chloride) ที่เย็น การทรานสฟอร์เมชันคอมพลีเทนเซลล์ โดยการผสมพลาสมิดดีเอ็นเอกับเซลล์ บ่มไว้ (incubating) บนน้าแข็ง 20-30 นาที และให้ความร้อนกระทั่งหัน (heat shock)ที่อุณหภูมิ 42 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 2 นาที ทาให้ดีเอ็นเอเข้าสู่เซลล์เซลล์ทรานสฟอร์มจะถูกบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 60-90 นาที ในอาหารเหลว เพื่อกระตุ้นลักษณะภายนอกให้แสดงออก หลังจากนั้นก็กระจายเชื้อในจานอาหารคัดเลือก (ภาพที่ 3.18)
ภาพที่ 3.18 การทรานสฟอร์เมชันโดยแคลเซียมคลอไรด์
ที่มา (Miesfeld, 1999, p. 43)
การทรานสฟอร์เมชันเป็นเทคนิคที่จาเป็นและต้องการผลผลิต 109 เซลล์ทรานสฟอร์แมนท์(transformants) ต่อไมโครกรัมดีเอ็นเอ (μg DNA) แต่ในทางปฏิบัติมักจะได้ประสิทธิภาพต่ากว่าคือประมาณ 106 เซลล์ทรานสฟอร์แมนท์ ต่อไมโครกรัมดีเอ็นเอ การทรานสแฟกชันคล้ายการทรานสฟอร์เมชัน แตกต่างโดยมีฟาจดีเอ็นเอแทนพลาสมิดดีเอ็นเอและใช้เซลล์สัตว์เป็นเจ้าบ้านส่วนสารเคมีที่ทาให้เซลล์สัตว์เป็นรูคือแคลเซียมฟอสเฟต (calcium phosphate) (ภาพที่ 3.19)
ภาพที่ 3.19 การทรานสแฟกชันในเซลล์สัตว์
ที่มา (Reece, 2004, p. 364)
2) ทรานสดักชัน (transduction) หรือการบรรจุฟาจดีเอ็นเอในหลอดทดลอง (packaging phage DNA in vitro) ระหว่างวัฏจักรไลติก (lytic cycle) ฟาจแลมป์ดา ฟาจดีเอ็นเอจะจาลองในระบบที่เรียกว่า คอนคาทาเมอร์ (concatemer) โมเลกุลดีเอ็นเอจะยาวประกอบด้วยก็อปปี้ของจีโนมแลมป์ดา เชื่อมกับบริเวณคอส (cos site) เมื่อดีเอ็นเอของฟาจ (phage DNA) รวมกับเปลือกหุ้มที่เรียกว่าแคปซิส (capsid) การตัดดีเอ็นเอที่บริเวณคอสจะใช้เอนไซม์เอนโด นิวคลีเอสของฟาจ (phage – encoded endonuclease) ฟาจที่โตเต็มที่ จะทาให้เซลล์เจ้าบ้านแตกสลาย และสามารถไปบุกรุกเซลล์เจ้าบ้านตัวอื่น กระบวนการนี้จะเกิดในสิ่งมีชีวิต (in vivo) มีความเป็นไปได้ที่จะทากระบวนการนี้ในหลอดทดลอง สามารถที่จะนารีคอมบิแนนท์ดีเอ็นเอเข้าสู่อนุภาคฟาจ กระบวนการบรรจุในหลอดทดลอง (in vitro) ของฟาจแลมป์ดาจะประกอบด้วย แคปซิสแลมป์ดา และเอนไซม์เอนโดนิวคลีเอส ในทางปฏิบัติ ใช้แบคทีเรียสองสายพันธุ์ในการผลิตไลเซต (lysate) ที่เรียกว่า สารบรรจุ (packaging extract) สายพันธุ์ที่กลายพันธุ์ในหนึ่งหน้าที่ของรูปร่างฟาจ (phage morphogenesis) ดังนั้นสารบรรจุยังไม่สามาถทางานในการแยก เมื่อผสมสองส่วนเข้าด้วยกันกับคอนคาเทอเมอริกรีคอมบิเนชันดีเอ็นเอ (concatemeric recombination DNA) ภายใต้สภาวะที่เหมาะสม องค์ประกอบที่สามารถหาได้และอนุภาคไวรัสจะถูกผลิต อนุภาคสามารถติดเชื้อเซลล์ E. coli และกระจายบนจานอาหารและมีพลัค (plaques) กระบวนการบรรจุในหลอดทดลอง (packaging in vitro ) (ภาพที่ 3.20)
ภาพที่ 3.20 การทรานดักชัน
ที่มา (Reece, 2004, pp. 130 – 136)
3) ทางเลือกของวิธีการถ่ายดีเอ็นเอ (Alternative DNA delivery methods) วิธีการเหนี่ยวนาดีเอ็นเอเข้าสู่เซลล์แบคทีเรียไม่ง่ายในการถ่ายยีนเข้าสู่เซลล์ชนิดอื่นๆ ระบบฟาจไม่สามารถใช้กับระบบอื่น และการทรานสฟอร์เมชันโดยวิธีปกติอาจจะมีความเป็นไปได้น้อยหรือไม่ได้เลย อย่างไรก็ตาม มีวิธีอื่นในการเหนี่ยวนาดีเอ็นเอเข้าสู่เซลล์ ปัญหาส่วนใหญ่ในการถ่ายดีเอ็นเอเข้าสู่เซลล์ที่ไม่ใช่แบคทีเรียเช่น เซลล์พืช เซลล์สัตว์ โดยเซลล์พืชจะมีผนังเซลล์ ขวางการถ่ายดีเอ็นเอ ต้องทาการเอาผนังเซลล์ออกโดยใช้เอนไซม์ย่อยสลายผนังเซลล์ เช่น เอนไซม์เซลลูเลส (ellulose) เรียกเซลล์พืชที่ไม่มีผนังเซลล์ว่า โปรโตพลาสต์ (protoplast)โปรโตพลาสต์ สามารถที่จะใช้ถ่ายยีนโดยเทคนิคอิเล็กโทรพอเรชัน (electroporation) คือการใช้กระแสไฟฟ้าทาให้เกิดรูชั่วคราวที่เยื่อหุ้มเซลล์และดีเอ็นเอก็จะผ่านเข้าไปในเซลล์ (ภาพที่ 3.21) โปรโตพ-ลาสต์สามารถที่จะเจริญเป็นต้นได้ (regenerate)โปรโตพลาสต์มีความสาคัญในการสร้างเซลล์พืชลูกผสม (hybrid plant cell) โดยกระบวนการหลอมโปรโตพลาสต์ (fusing protoplast)
ภาพที่ 3.21 การถ่ายยีนโดยวิธีอิเล็กโทรพอเรชัน
ที่มา (Miesfeld, 1999, p. 43)
ทางเลือกในการถ่ายยีนโดยใช้วิธีทางฟิสิกส์ (physical method)โดยการใช้เข็มขนาดเล็ดฉีดดีเอ็นเอเข้าสู่นิวเคลียสโดยตรง เรียกเทคนิคนี้ว่า ไมโครอินเจกชัน (microinjection) (ภาพที่ 3.22) ซึ่งเทคนิคนี้สามารถทาได้ทั้งในเซลล์พืชและเซลล์สัตว์ เซลล์จะถูกจับโดยมีหลอดแก้วดูดไว้และใช้เข็มแทงผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ เทคนิคนี้ต้องการเครื่องไมโครแมนนิพูเลเตอร์ (manipulator) เเละกล้องจุลทรรศน์ (microscope)
ภาพที่ 3.22 การถ่ายยีนโดยวิธีไมโครอินเจกชัน
ที่มา ((a) Wallace et al., 1996, p. 330 (b) Miesfeld, 1999, p. 215 (c) Nicholl, 2002, p. 83))
มีการพัฒนาเทคนิคการถ่ายยีนเข้าสู่พืชอีกแบบหนึ่งว่า ไบโอลิสติก (biolistic) ซึ่งจะมีการยิงดีเอ็นเอเข้าสู่เซลล์ (ภาพที่ 3.23) โดยดีเอ็นเอจะเคลือบบนอนุภาคทังสเตน แล้วยิงเรียกว่า ไมโครโปรเจกไทด์(microprojectiles) โดยใช้แก็สในการยิง เข้าสู่เซลล์พืช
ภาพที่ 3.23 การถ่ายยีนโดยวิธีไบโอลิสติก
ที่มา (Hayes & Reichsman, 2010, p. 336)
3.5 การคัดเลือกสิ่งมีชีวิตที่ผ่านขั้นตอนพันธุวิศวกรรม
มีเทคนิคหลากหลายในการคัดเลือกสิ่งมีชีวิตที่ผ่านขั้นตอนพันธุวิศวกรรม การคัดเลือกจะเกี่ยวกับการต้านยาปฏิชีวนะ (antibiotic) ซึ่งใช้ในช่วงการเจริญของเซลล์ที่มีรีคอมบิแนนท์ดีเอ็นเอ เซลล์จะคัดเลือกได้โดยการมีชีวิตรอดในอาหารที่มียาปฏิชีวนะ โดยปกติขึ้นกับเวกเตอร์หรือการออกแบบลาดับเบสที่โคลนก็สามารถคัดเลือกโดยตรง หนึ่งในวิธีการคัดเลือกทางพันธุกรรมที่ง่ายเกี่ยวกับการใช้ยาปฏิชีวนะ ในการมีอยู่ของโมเลกุลเวกเตอร์หรือที่เรียกว่าอินเซอชันอินแอคติเวชัน (Insertional inactivation) นอกจากนี้อาจจะดูได้จากสีของโคโลนี (chromogenic substrates)
1) อินเซอชันอินแอคติเวชัน การมีอยู่ของชิ้นดีเอ็นเอที่จะโคลนสามารถตรวจสอบถ้าชิ้นอินเซอส (insert) ขัดขวางการทางานของรหัสพันธุกรรมของยีน เรียกว่าอินเซอชันนอลอินแอคติเวชัน การต้านยาปฏิชีวนะสามารถใช้ประโยชน์จากระบบอินเซอชันนอลอินแอคติเวชัน ถ้าชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่โคลนจะเข้าสู่บริเวณเอนไซม์ตัดจาเพาะของบริเวณยีนต้านยาปฏิชีวนะ ตัวอย่างเช่น การโคลนดีเอ็นเอเข้าสู่บริเวณ Pst I ของพลาสมิด pBR322 (ต้านยาแอมพิซิลลิน) ทาให้ขัดขวางการทางานของยีน เซลล์ที่ได้รับรีคอมบิแนนท์พลาสมิดหรือสิ่งมีชีวิตที่ผ่านขั้นตอนพันธุวิศวกรรม จะไวต่อแอมพิซิลลินแต่ต้านเททราไซคลิน (Aps Tcr) โดยจะไม่โตในอาหารที่ผสมแอมพิซิลลิน แต่จะโตในอาหารที่ผสมเททราไซคลิน ถ้าในกรณีนอน-รีคอมบิแนนท์ จะต้านยาได้ทั้งสองชนิด (ภาพที่ 3.24)
ภาพที่ 3.24 อินเซอชันอินแอคติเวชัน
ที่มา (Clark & Pazdernik , 2009, pp. 75)
2) การใช้สารโครโมจีนิก การใช้ประโยชน์ของสารโครโมจีนิก ในวิธีการคัดเลือกรีคอมบิแนนท์หรือสิ่งมีชีวิตที่ผ่านขั้นตอนพันธุวิศวกรรม ได้มีความสาคัญในการพัฒนาเทคโนโลยี ระบบเกี่ยวกับสารประกอบเอ็กซ กัลส์ (X-gal , 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) ซึ่งเป็นสารตั้งต้นไม่มีสีสาหรับเอนไซม์บีต้า กาแลกโตซิเดส (β-galactosidase) เอนไซม์ซึ่งปกติจะมีใน E. coli เมื่อมีน้าตาลแลกโทส (lactose) อย่างไรก็ตาม สามารถเหนี่ยวนาโดยการใช้แลกโทส อะนาล็อก (lactose analogue) เช่น สารไอพีทีจี (IPTG , isopropyl-thiogalactoside) การตัดสารเอ็กซ กัลจะเกิดเป็นสีน้าเงิน การแสดงออกของยีนแลกแซด (lacZ , β-galactosidase) สามารถตรวจสอบได้ง่าย ในทั้งเซลล์และพลัค ระบบการตรวจสอบเอ็กซ์ กัลส์ สามารถใช้ประโยชน์จากยีนเอนไซม์บีต้า กาแลกโตซิเดส ในระบบเซลล์เจ้าบ้าน / เวกเตอร์ โดยการมีระบบอัลฟาคอมพลีเมนเทชัน (α complementation) คือบางส่วนของยีนแลกแซดจะอยู่ที่เวกเตอร์และบางส่วนจะอยู่ที่เซลล์เจ้าบ้าน เวกเตอร์จะให้ชิ้นส่วนที่เรียกว่าชิ้นเปปไทด์ (peptide fragment) ที่เรียกว่า อัลฟา-เปปไทด์ (α-peptide) และบริเวณที่ให้รหัสสาหรับ LacZ’ ของเซลล์เจ้าบ้านจะมี LacZ’+ จะผลิตเมื่อชิ้นส่วนเซลล์เจ้าบ้านและชิ้นส่วนเวกเตอร์เพื่อทาหน้าที่เป็นเอนไซม์บีต้า กาแลกโตซิเดสที่สมบรูณ์และทาให้เกิดโคโลนีสีฟ้าเมื่ออยู่ในอาหารคัดเลือกที่ผสมสารเอ็กซ กัลส์และไอพีทีจี
ระบบเอ็กซ กัลส์ สามารถที่จะคัดเลือกสิ่งมีชีวิตที่ผ่านขั้นตอนพันธุวิศวกรรมได้สาเร็จ ถ้าชิ้นส่วนดีเอ็นเอถูกตัดต่อในดีเอ็นเอพาหะบริเวณยีนบีต้า กาแลกโตซิเดส ทาให้ไม่สามารถสร้างเอนไซม์ บีต้า กาแลกโตซิเดส แบคทีเรียหรือสิ่งมีชีวิตที่ได้รับดีเอ็นเอลูกผสมทาให้เกิดโคโลนีสีขาว เมื่ออยู่ในอาหารคัดเลือกที่ผสมสารเอ็กซ กัลส์และไอพีทีจี (ภาพที่ 3.25)
ภาพที่ 3.25 การใช้สารโครโมจีนิก
ที่มา ((a) Reece, 2004, p. 120) , (b) Wallace et al., 1996, p. 322
บทสรุป
พันธุวิศวกรรม หมายถึง การตัดต่อยีนจากสิ่งมีชีวิตต่างชนิดกันเพื่อให้เกิดการเปลี่ยนแปลงลักษณะพันธุกรรมที่มนุษย์ต้องการ มีการพัฒนาความรู้ด้านพันธุวิศวกรรม มากกว่า 30 ปี ในห้องปฏิบัติการทดลองทั่วโลก มีการแยกชิ้นดีเอ็นเอจากจีโนมของสิ่งมีชีวิต แล้วทาการหาลาดับเบส และทาการหาหน้าที่ พันธุวิศวกรรมสามารถนาไปประยุกต์ใช้ทางการแพทย์ และอุตสาหกรรมทางเทคโนโลยีชีวภาพ พันธุวิศวกรรมประกอบด้วยขั้นตอน ต่างๆ ได้แก่ การสร้างดีเอ็นเอลูกผสมโดยการตัดต่อยีน การตัดต่อยีนนี้จะใช้เอนไซม์ตัดจาเพาะชนิดที่สองและเอนไซม์ไลเกส เมื่อได้ดีเอ็นเอลูกผสมแล้วจึงนาเข้าสู่เซลล์เจ้าบ้านหรือเรียกว่าการถ่ายยีน โดยเทคนิคทรานสฟอร์เมชัน ทรานสแฟกชันหรือทรานสดักชัน นอกจากวิธีที่กล่าวมาแล้วอาจจะใช้วิธีอื่น ๆ ได้อีก เช่น อิเล็กโทรพอเรชัน หรือ ไมโครอินเจกชัน หรือไบโอลิสติก เป็นต้น ขั้นตอนสุดท้ายในกระบวนการพันธุวิศวกรรมก็คือ การคัดเลือกสิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรม การคัดเลือกจะเกี่ยวกับการต้านยาปฏิชีวนะ โดยการมีชีวิตรอดในอาหารที่มียาปฏิชีวนะ โดยปกติขึ้นกับเวกเตอร์หรือการออกแบบลาดับเบสที่โคลนก็สามารถคัดเลือกโดยตรง เรียกวิธีการคัดเลือกทางพันธุกรรมที่ง่ายเกี่ยวกับการใช้ยาปฏิชีวนะ ในการมีอยู่ของโมเลกุลเวกเตอร์ว่าอินเซอชันอินแอคติเวชัน นอกจากนี้อาจจะดูได้จากสีของโคโลนี
คำถามทบทวน
1. เปรียบเทียบการจัดเรียงตัวของยีนในเซลล์โปรคารีโอติกและยูคารีโอติก
2. อธิบายความหมายพันธุวิศวกรรมและการนาไปใช้ประโชยน์
3. การตัดต่อยีนรายละเอียดและวิธีการอย่างไร
4. ยกตัวอย่างนักวิทยาศาสตร์ที่มีความสาคัญต่อกระบวนการพันธุวิศวกรรม
5. กลุ่มเอนไซม์โพลีเมอเรสมีความสาคัญอย่างไรต่อกระบวนการพันธุวิศวกรรม
6. อธิบายการนายีนเข้าสู่เซลล์เจ้าบ้านโดยการทรานสฟอร์เมชัน ทรานสแฟกชันและทรานสดักชัน
7. เซลล์เจ้าบ้านที่ใช้ในกระบวนการพันธุวิศวกรรมได้แก่อะไรบ้าง
8. เวกเตอร์ที่ใช้ในการเพิ่มจานวนดีเอ็นเอและผลิตโปรตีน มีความเหมือนหรือต่างกันอย่างไร
9. การถ่ายยีนโดยวิธีการทางฟิสิกส์ มีวิธีการอย่างไร
10. การคัดเลือกสิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรม มีรายละเอียดอย่างไร
เอกสารอ้างอิง
Brown, T.A. (2010). An introduction Gene cloning & DNA analysis (6 th ed.). United
States of America : Wiley – Blackwell.
Brown, T.A. (1999). Genomes. United States of America : BIOS Scientific Publishers.
Campbell, M.K. & Farrell, S.O. (2003). Biochemistry (4 th ed.). United States of America : Thomson
Learning, Inc.
Clark, D.P. & Pazdernik, N.J. (2009). Biotechnology applying the genetic revolution. United States of
America : Elsevier academic press.
Glick, B.R. & Pasternak, J.J. (1998). Molecular Biotechnology : Principle and Applications of
Recombinant DNA (2 nd ed.). Washington, DC : American Society for Microbiology.
Hayes, M. F. & Reichsman, F. (2010). DNA and Biotechnology (3rd ed.). United States of America: Acadermic Press publications.
Miesfeld, R.L. (1999). Applied molecular genetics. Canada : Wiley – Liss, Inc.
Nicholl, D.S.T. (2002). An introduction Genetic Engineering (2 nd ed.). South Asia. New Delhi.
Cambridge University Press.
Reece, R.J. (2004). Analysis of gene and genomes. England. John Wiley & Sons.
Wallace, R.A., Sanders, G.P.& Ferl, R.J. (1996). Biology : The science of life (4 th ed.). United
States of America : Harper Collins Publishers Inc.
